一种猪伪狂犬病等温PCR现场快速检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种猪伪狂犬病等温PCR现场快速检测试剂盒，由一套引物、10倍环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成；所述的一套引物是由一对引物和一对内引物组成。采用本发明可以定性定量检测猪伪狂犬病。本发明利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备，只需眼观反应管道颜色变化即可判定，因此具有特异性、敏感性高和检测时间比普通PCR短、适用于猪场现场的快速检测等特点。

主权项

一种猪伪狂犬病等温PCR现场快速检测试剂盒，其特征在于，由一套引物、10倍环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成；所述的一套引物是由一对引物和一对内引物组成，其序列为：引物1：TCCGGATCTACCTCGACG引物2：CCTCCTCGCTCAGGCT内引物1：TCGGCTCGGGCACGTACAGCTACGGCACCGGCAAGA内引物2：CGTACTGGCGCACTCTGTTCGGTTCTGCTTCCGGGTCTGC其中，所述的一对引物与一对内引物的摩尔数之比为1∶6～9；所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述的阳性对照为含有插入猪伪狂犬病一段特异序列的阳性质粒，环介导等温扩增反应扩增区位于该特异序列中，其浓度为10⁷拷贝/μL；所述的阴性对照为灭菌双蒸水；所述的显色剂为20倍SYBR Green I，所述的阳性质粒的制作方法为：采用PCR扩增一段猪伪狂犬病TK基因特异序列，然后装入PMD18‑T载体，转化至DH5α感受态细菌，抽取质粒DNA经序列确定后，采用紫外分光光度计测定质粒DNA的浓度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至10⁷拷贝/μL。