一种非诺特罗的胶体金检测卡及其制备方法

摘要

本发明公开一种非诺特罗的胶体金检测卡及其制备方法，包括卡壳及设置于卡壳内的试纸条，试纸条上沿液体流动方向依次设置有样本垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，金标结合物垫上包被有抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物，抗非诺特罗单克隆抗体-胶体金结合物中的抗非诺特罗单克隆抗体是以非诺特罗偶联抗原Ⅰ为免疫抗原制备的，硝酸纤维素膜上邻近金标结合物垫的一端设置有检测线，且硝酸纤维素膜上邻近吸水垫的一端设置有质控线，检测线上包被有非诺特罗偶联抗原Ⅱ，质控线上包被有抗鼠二抗。本发明制备的非诺特罗的胶体金检测卡具有成本低、灵敏度高、操作简便、无需仪器、特异性强、稳定性好、结果准确、易于判读、可现场检测等优点。

主权项

一种非诺特罗的胶体金检测卡制备方法，其特征在于：包括以下步骤：一、金标结合物垫的制备：a、合成非诺特罗偶联抗原Ⅰ：取载体蛋白，用双蒸水溶解后，再用NaOH调pH至10，加入1,4‑丁二醇二缩水甘油醚，在氮气保护下，避光搅拌24小时，通过柱层析纯化制得接臂载体蛋白，所述1,4‑丁二醇二缩水甘油醚与蛋白载体的摩尔比为100：1，将非诺特罗调成碱性后，在搅拌条件下缓慢加入到接臂载体蛋白中，氮气保护下室温避光搅拌24小时，反应产物在4℃用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液透析3天，透析后得到非诺特罗偶联抗原Ⅰ；b、免疫动物：将上述步骤a中制成的非诺特罗偶联抗原Ⅰ与等量弗氏完全佐剂乳化完全后，免疫小鼠；c、细胞融合和杂交瘤细胞筛选：取经非诺特罗偶联抗原Ⅰ免疫的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用HAT培养基进行培养，对培养上清进行检测，筛选获得稳定分泌抗非诺特罗单克隆抗体的细胞株14F8‑B3‑C9；d、制备腹水：将分泌抗非诺特罗单克隆抗体的细胞株14F8‑B3‑C9培养后，注射入BALB/C小鼠腹腔，收集其腹水；e、抗非诺特罗单克隆抗体的纯化制备：采用硫酸铵沉淀法对腹水进行透析、过滤处理，采用非诺特罗亲和层析柱对经透析、过滤处理的上清进行纯化，提纯制备出抗非诺特罗单克隆抗体；f、胶体金溶液制备：在超纯水中加入1％氯金酸，加热煮沸，迅速加入1％柠檬酸三钠，继续煮沸15分钟，所述超纯水、氯金酸、柠檬酸三钠的体积比为99：1：1，冷却后用超纯水恢复至原来的体积，4℃保存备用；g、抗非诺特罗单克隆抗体‑胶体金结合物溶液的制备：将胶体金溶液调pH至6.0后，用20μg/mL浓度的抗非诺特罗单克隆抗体反应1小时，然后用10％牛血清白蛋白进行封闭，4℃ 7500g离心30分钟，去上清，胶体金沉淀用1/10胶体金体积的金标复溶液进行溶解，制成抗非诺特罗单克隆抗体‑胶体金结合物溶液，所述胶体金溶液、抗非诺特罗单克隆抗体、牛血清白蛋白的体积比为100：10：5；h、制备金标结合物垫：将上述制备的抗非诺特罗单克隆抗体‑胶体金结合物溶液以4μL/cm喷量喷涂于结合物垫上，37度干燥3小时后，放于湿度低于20％的干燥柜保存备用；二、硝酸纤维素膜的制备：a、合成非诺特罗偶联抗原Ⅱ：将对氨基苯甲酸、亚硝酸钠溶于pH2.0的溶液中，在冰浴和避光条件下磁力搅拌反应4小时，制得重氮盐，所述对氨基苯甲酸、亚硝酸钠的质量比为1：2，将该重氮盐与非诺特罗反应，生成非诺特罗衍生物，产物经柱层析纯化，将纯化后的非诺特罗衍生物与载体蛋白按摩尔比50:1，采用EDC/NHS法合成非诺特罗偶联抗原Ⅱ，然后在4℃用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析3天，得到纯化的非诺特罗偶联抗原Ⅱ；b、制备硝酸纤维素膜：以0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液为稀释液，将非诺特罗偶联抗原Ⅱ稀释至0.5mg/mL，并以1μL/cm喷量喷涂于硝酸纤维素膜的一端作为检测线，将抗鼠二抗稀释至1.0mg/mL，并以1μL/cm喷量喷涂于硝酸纤维素膜的另一端作为质控线，37℃干燥2小时后，密封，室温保存备用；三、非诺特罗的胶体金检测卡的组装：在底板上依次粘贴样本垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从而组装成试纸条，所述硝酸纤维素膜包被非诺特罗偶联抗原Ⅱ的一端搭接金标结合物垫，且硝酸纤维素膜包被抗鼠二抗的一端搭接吸水垫，将试纸条剪切成一定宽度后装于卡壳中。