一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法

摘要

本发明涉及一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法，包括：按照多个基因的相对表达量将相应的PCR引物分为两组，并在组内调整引物浓度比例；构建标准品竞争性模板和待测样品竞争性模板，进行三轮多重竞争性PCR反应；混合第三轮反应产物作为二代测试平台文库上机测序，提取数据并分析，即可得到不同样本间多个基因相对表达量差异。本发明基于高速发展的二代测序平台，准确快速定量目标模板和内参照模板，并可以同时对多个样本进行5个目的基因表达差异分析，流程简单易行，价格低廉；当需要分析多样本间多基因表达差异时，不失为一种具有高准确度，通量适中，成本廉价的方法。

主权项

一种基于二代测试平台的中通量基因表达分析方法，包括：(1)按照多个基因的相对表达量将基因相应的PCR引物分为两组，并在组内调整引物浓度比例；其中，多个基因包括看家基因和目标基因；(2)将步骤(1)中每个基因的两组逆转录引物A和B，以标准品RNA为模板分别进行A，B两组多重逆转录反应，构建标准品A，B竞争性模板；以待测样品RNA为模板进行B组多重逆转录反应，构建待测样品B竞争性模板；其中，逆转录引物A和B中引入相邻两个位点单碱基突变，逆转录后得到两种单碱基差异的cDNA；(3)利用步骤(2)中的标准品A，B竞争性模板和待测样品B竞争性模板进行三轮多重竞争性PCR；(4)混合所有步骤(3)中得到的第三轮反应产物作为二代测试平台文库上机测序，提取数据并计算测定序列数，根据标准品梯度比例数据绘制标准曲线，校准待测样本数据，将看家基因归一化处理后，即可得到不同样本间多个基因相对表达量差异。