新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量检测试剂及检测方法

摘要

本发明涉及一种新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量RT-PCR检测试剂及检测方法，属于动物检疫技术领域。本发明分别选择新城疫病毒M基因编码区特定序列、禽流感病毒H9亚型H基因编码区特定序列、鸡传染性支气管炎病毒M基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%—60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于5℃。为保证新城疫病毒探针的通用，探针的长度仅为13个碱基，采用LAN修饰，以提高其Tm值；其它两种病毒探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。

主权项

一种新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量RT‑PCR检测试剂，其特征在于，含有以下引物：NDV‑F：5’TATGRTGRTAACWTGCAAGAAGAG3’，NDV‑R为：5’GCTTTCACRTGCTTVACTG3’，NDV‑P：5' FAM ‑TA+G TG+C AG+G CA+C C‑TAMRA 3' ，H9‑F：5’ATGGGGTTTGCTGCC 3’ ，H9‑R：5’AATTATATACAAATGTTGCAYCTG 3’，H9‑P：5’ HEX‑ TTCTGGGCYATGTCYAAYGG‑BHQ1‑3’，IBV‑F：5’CTATCGCCAGGGAAATGTC3’，IBV‑R：5’GCGTCCTAGTGCTGTACCC3’，IBV‑P：5’CY5‑ CCTGGAAACGAACGGTAGACCCT‑BHQ2 ‑3’,其中，NDV‑P：5' FAM‑TA+G TG+C AG+G CA+C C‑TAMRA 3'中“+”后面的碱基代表LNA修饰。