发明名称 |
植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法 |
摘要 |
本发明公开一种植物乳杆菌素<i>pln</i>E和<i>pln</i>F的异源表达方法,从NCBI上查到<i>pln</i>E和<i>pln</i>F的基因序列,序列号为,并在序列的N-端添加肠激酶位点,设计酶切位点<i>Kpn </i>I和<i>Nco </i>I,合成序列;分别质粒pUC57-<i>pln</i>E和pUC57-<i>pln</i>F为模板,设计引物进行<i>pln</i>E和<i>pln</i>F片段的PCR扩增,通过pET-32a质粒和目的片段双酶切后,成功构建重组质粒pET-32a-<i>pln</i>E和pET-32a-<i>pln</i>F,转化至大肠杆菌<i>E. coli </i>DH5α并保存。本发明利用大肠杆菌异源表达体系,构建表达质粒并实现其在大肠杆菌的高效表达,使得大量制备PlnE/F成为可能,从而为其作用机理研究及其今后在食品领域中的应用提供基础。 |
申请公布号 |
CN105671061A |
申请公布日期 |
2016.06.15 |
申请号 |
CN201510776886.3 |
申请日期 |
2015.11.12 |
申请人 |
浙江工商大学 |
发明人 |
郦萍;顾青;吴双双 |
分类号 |
C12N15/31(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C07K14/335(2006.01)I |
主分类号 |
C12N15/31(2006.01)I |
代理机构 |
杭州中成专利事务所有限公司 33212 |
代理人 |
冉国政 |
主权项 |
植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法,其特征在于包括下述步骤:(1)从NCBI上查到plnE和plnF的基因序列,在切除前导肽序列后的plnE和plnF基因序列的5'端添加一个肠激酶位点,其基因序列为:5'‑GATGATGATGATAAA‑3';根据质粒pET‑32a(+)的多克隆位点,选取两个酶切位点Kpn I和Nco I,序列分别为5'‑GGTACC‑3'和5'‑CTCGAG‑3',两端最后加入保护碱基,人工合成SEQ ID No.3所示的plnE序列和SEQ ID No.4序列所示的plnF序列;(2)分别以质粒pUC57‑plnE和pUC57‑plnF为模板,PCR扩增plnE和plnF片段,分别将纯化后的plnE和plnF的PCR产物和pET‑32a质粒进行50μL体系双酶切,利用T4连接酶将酶切纯化后的pET‑32a(+)线性质粒载体片段分别与PCR酶切回收产物plnE和plnF片段进行连接,得到重组质粒pET‑32a‑plnE和pET‑32a‑plnF;(3)重组质粒pET‑32a‑plnE和pET‑32a‑plnF转化入大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)中,得到工程菌株BL21‑pET‑32a‑plnE和BL21‑pET‑32a‑plnF;(4)分别挑取工程菌BL21‑pET‑32a‑plnE和BL21‑pET‑32a‑plnF单菌落在LB液体培养基中,37℃培养过夜;按2%接种于含50μg/mL Ampr的LB液体培养基中,37℃摇菌培养至OD600达到0.6;加1mM IPTG进行诱导,200rpm的条件下诱导6h。 |
地址 |
310012 浙江省杭州市西湖区教工路149号 |