一种碱性磷酸酶的制取方法

摘要

本发明涉及一种碱性磷酸酶的制取方法，关键步骤为：将动物屠宰后的废弃脏器经绞碎离心后获得碱性磷酸酶粗酶液，再采用酸沉、盐析、柱层析、透析、真空冷冻干燥等一系列工艺，最后得到碱性磷酸酶，其比酶活达到402U/mg以上。本发明制取的碱性磷酸酶的回收率高于10％，纯化倍数达到1297倍以上，整个工艺具有周期短、生产设备典型、操作工艺简单、成本低、效率高、产品纯度高等优点，适合产业化推广。

主权项

一种碱性磷酸酶的制取方法，其特征为：(1)粗酶液的制备：动物屠宰废弃脏器剪碎，加Tris‑HCl缓冲液匀浆，4℃下搅拌后离心，上清液即为碱性磷酸酶粗酶液；(2)酸沉淀：所得粗酶液，用HAc调节pH，搅拌后离心，沉淀溶于Tris‑HCl缓冲液中，加正丁醇搅拌后离心，吸取水层对Tris‑HCl缓冲液透析并浓缩；(3)(NH₄)₂SO₄盐析：用(NH₄)₂SO₄进行分段盐析，沉淀用Tris‑HCl缓冲液，溶解并透析；(4)DEAE‑Sephacel柱层析：透析液上样于DEAE‑Sephacel柱，上样后用NaCl梯度洗脱，收集碱性磷酸酶活性部分，用Tris‑HCl缓冲液透析浓缩备用；(5)ConA‑Sepharose柱层析：浓缩液上样于平衡的ConA‑Sepharose柱，甲基甘露糖苷洗脱，收集碱性磷酸酶活性部分，用Tris‑HC l缓冲液透析浓缩备用；(6)SephadexG‑200柱层析：浓缩液上样于平衡后的Sephadex G‑200柱，同一缓冲液洗脱，收集碱性磷酸酶活性部分，透析浓缩后备用；(7)GGT免疫亲和层析柱：浓缩液过抗GGT免疫亲和层析柱，收集流出液，用Tris‑HCl缓冲液透析后置‑70℃冻干获得碱性磷酸酶产品。