发明名称 赤魟软骨蛋白抗氧化肽的制备方法
摘要 本发明公开了一种赤魟软骨蛋白抗氧化肽的制备方法。本发明以以赤魟软骨为原料,通过总蛋白提取、丙酮分级沉淀、胰蛋白酶酶解得酶解液,酶解液采用超滤、离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化肽Ile-Glu-Pro-His,ESI-MS测定分子量为494.55 Da;制备的高活性抗氧化肽对DPPH自由基、羟自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用,且有良好的脂质过氧化抑制作用,具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点,可以作为药品、保健食品或食品添加剂等。
申请公布号 CN105648006A 申请公布日期 2016.06.08
申请号 CN201511014864.X 申请日期 2015.12.31
申请人 浙江海洋学院 发明人 王斌;杨帆;赵玉勤
分类号 C12P21/06(2006.01)I;C07K5/103(2006.01)I;C07K1/36(2006.01)I;C07K1/34(2006.01)I;C07K1/20(2006.01)I;C07K1/18(2006.01)I;C07K1/16(2006.01)I 主分类号 C12P21/06(2006.01)I
代理机构 杭州浙科专利事务所(普通合伙) 33213 代理人 吴秉中
主权项 赤魟软骨蛋白抗氧化肽的制备方法,其特征在于包括以下步骤:1)赤魟软骨总蛋白粗提物的制备:称取孔鳐软骨切成小碎块,加入适量蒸馏水,在高速组织捣碎机中匀浆至糊状,将糊状的赤魟软骨浸于4~6倍体积的1.0 mol/L盐酸胍溶液中,该盐酸胍溶液中含0.02 mol/L MES、 0.02 mol/L EDTA及pH值为7~8,于4 ℃下搅拌抽提36~48 h;提取液在4 ℃下以4000~6000 r/min离心15~25 min,弃残渣收集上清液;上清液继续在4 ℃、10000~12000 r/min离心15~25 min,取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤除去不溶性杂质;将滤液装入分子截留量为8 000的透析袋中,用pH 值为7.6的Tris‑HCl缓冲液于4 ℃下透析24~48 h,透析袋内溶液即为赤魟软骨总蛋白粗提物;2)赤魟软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备:取赤魟软骨总蛋白粗提物在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%,在‑20 ℃下静置4~6 h后,于4 ℃、10000~12000 r/min高速离心20 min,取上清液,加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%,获得赤魟软骨60%丙酮沉淀蛋白,冻干,即为60%丙酮分级沉淀蛋白;3)赤魟软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解:取赤魟软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比1g:3~5 mL溶于Tris‑HCl缓冲液,该缓冲液为0.05mol/L、pH 值为7.5~8.5,按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.0~3.0%加入1.9×10<sup>4 </sup>U/g的胰蛋白酶,于40 ℃酶解3~5 h,然后于90 ℃、10 min灭酶活,酶解液于4 ℃、10000~12000 r/min离心15~25 min,弃残渣收集上清液,得软骨蛋白酶解液;4)赤魟软骨蛋白抗氧化肽的制备:将上述酶解液采用3 kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于3 kDa部分,冻干,得超滤酶解物;将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化,得抗氧化肽。
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