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检测血液中内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的方法，其特征在于按以下步骤进行：(一)细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs的分离提取:a、抽取外周血液样品3‑10ml置于抗凝管保存；用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)稀释2－4倍，进行离心得到上清液血浆；b:对上清液血浆再次进行离心分离，沉淀物为MVs，c:对步骤b的上清液血浆进行超速离心分离，沉淀物为EXs；(二)对细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs进行特异性抗体标记及检测和分析有：a、EC‑MVs及EC‑EXs分选：1)用CD105和CD144作为ECs的分子标记，用PBS分别悬浮MVs和EXs，加入生物素偶联的anti‑human‑CD105抗体,4℃孵育24小时；2)将anti‑biotin偶联的磁珠分别加入悬浮后的MVs和EXs样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠后得到CD105+MV和CD105+EX悬浮液；3)将所得的CD105+MV和CD105+EX悬浮液分别加入biotin偶联的anti‑human‑CD144抗体,4℃孵育24小时；4)将anti‑biotin偶联的磁珠分别加入上述3)的样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠得到CD105+CD144+MV和CD105+CD144+EX悬浮液；5)将CD105+CD144+MV悬浮液20000r/s离心120min，所得沉淀即为CD105+CD144+MVs(EC‑MVs)，将CD105+CD144+EX悬浮液169000r/s超速离心6h,所得沉淀即为CD105+CD144+EXs(EC‑EXs)；6)利用常规质谱和RNAseq鉴定EC‑MVs和EC‑EXs所含的蛋白和RNAs(mRNAs和miRNAs),利用常规蛋白质印迹和实时荧光定量PCR分析EC‑MVs和EC‑EXs中特定蛋白和RNA的表达；b、EPC‑MVs及EPC‑EXs分选：1)用CD34和KDR作为EPCs的分子标记，用PBS分别悬浮MVs和EXs，加入biotin偶联的anti‑human‑CD34抗体4℃孵育24小时；2)将anti‑biotin偶联的磁珠分别加入上述1)的悬浮MVs和EXs样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠后得到CD34+MV和CD34+EX悬浮液；3)将上述2)所得的CD34+MV和CD34+EX悬浮液分别加入biotin偶联的anti‑human‑KDR抗体，4℃孵育24小时；4)将anti‑biotin偶联的磁珠分别加入上述3)的样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠得到CD34+KDR+MV和CD34+KDR+EX悬浮液；5)将所得的CD34+KDR+MV悬浮液20000r/s离心120min，沉淀即为CD105+CD144+MVs(EPC‑MVs)，所得的CD34+KDR+EX悬浮液169000r/s超速离心6h,沉淀即为CD105+CD144+EXs(EPC‑EXs)；6)利用常规质谱和RNAseq鉴定EPC‑MVs和EPC‑EXs所含的蛋白和RNAs(mRNAs和miRNAs)；利用常规蛋白质印迹和实时荧光定量PCR分析EPC‑MVs和EPC‑EXs中特定蛋白和RNA的表达。c、EC‑MVs及EC‑EXs水平检测：1)用CD105和CD144作为ECs的分子标记，Annexin V作为MVs的普遍标记，CD105+MV及CD105+EX悬浮液的提取同上述EC‑MVs及EC‑EXs分选；2)将上述得到的CD105+MV及CD105+EX悬浮液分别与anti‑human‑CD144或者anti‑human‑Annexin V抗体4℃孵育24小时；再分别与量子点(Qdots)655标记的CD144或者Annexin V二抗,室温孵育90mins；3)经过滤处理的PBS清洗后，所得的EC‑MVs和EC‑EXs进行NTA分析；采用NanoSight NS300分析仪在405nm激光器下进行检测,记录60s内EC‑MVs和EC‑EXs的平均大小和浓度；d、EPC‑MVs及EPC‑EXs水平检测：1)CD34和KDR作为EPCs的分子标记,CD63作为EXs的普遍标记，CD34+MV及CD34+EX悬浮液的提取同上述EPC‑MVs及EPC‑EXs分选；2)将上述得到的CD34+MV及CD34+EX悬浮液与anti‑human‑KDR或者anti‑human‑CD63抗体4℃孵育24小时；再分别与量子点(Qdots)655标记的KDR或者CD63二抗,室温孵育90mins；3)经过滤处理的PBS清洗后，所得的EPC‑MVs及EPC‑EXs进行NTA分析；采用NanoSight NS300分析仪在405nm激光器下进行检测,记录60s内EPC‑MVs及EPC‑EXs的平均大小和浓度。 |
