利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法

摘要

本发明提供一种利用dot-ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法，属于植物保护领域。该发明通过对灰飞虱的采集和研磨后，利用水稻条纹病毒单克隆抗体，建立检测单头介体灰飞虱携带水稻条纹病毒的dot-ELISA体系。该检测方法灵敏度高、特异性强，适用于大批量的单头灰飞虱样品检测，且不需要特殊仪器设备，具有结果判定简单易行、检测结果便于长期保存等特点，可对田间灰飞虱携带水稻条纹病毒的带毒率进行大规模调查和检测，为田间水稻条纹叶枯病的爆发流行进行预测预报并采取相应的防控措施提供技术支撑。

主权项

利用dot‑ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法，其特征在于，利用dot‑ELISA检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒的方法包括以下步骤：（1）灰飞虱的采集及保存: 在田间采集灰飞虱，放入提前准备好水稻苗的培养瓶中备用；或直接将灰飞虱放入75%的酒精瓶中保存；将暂不进行检测的灰飞虱放入‑20℃或‑80℃冰箱中保存；（2）灰飞虱研磨：用灭菌牙签挑取单头灰飞虱，置于干净并已装有3‑5颗1‑3mm小钢珠的1.5mL离心管中，每个离心管中加0.01 mol/L PBS缓冲液后，放于高通量组织研磨仪中振荡研磨至明显组织消失；或者将单头灰飞虱放入1.5mL离心管中，每个离心管中加0.01mol/L PBS缓冲液后，用组织研磨棒捣碎至明显组织消失，用PBS缓冲液研磨灰飞虱时，PBS缓冲液的用量为150‑250μL；高通量组织研磨仪的振荡频率为60Hz，振荡研磨时间为60‑90s；离心机离心条件为4℃，12000rpm，离心3‑10min；研磨后把1.5mL离心管放到离心机中离心，使沉淀沉于底部取出上清待用；（3）硝酸纤维素（NC）膜准备：用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格0.7×0.7cm，平整放入培养皿中央；（4）取2 μL灰飞虱研磨液的上清液点到NC膜的方格中央；室温干燥20min；重复点一次样，室温干燥；（5）将NC膜浸入到能覆盖NC膜的含5%脱脂奶粉封闭液中，室温封闭，NC膜封闭时间为30‑90min；（6）加入用含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液稀释的水稻条纹病毒单克隆抗体至覆盖NC膜，37℃孵育，水稻条纹病毒单克隆抗体使用前，经过含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液按1:5000‑1:10000的比例稀释处理后，37℃孵育30‑90min；（7）弃液体，加PBST缓冲液至覆盖NC膜，洗膜5‑6次，每次3min，最后一次用PBS缓冲液洗；（8）弃洗脱液，加入用含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗至覆盖NC膜，室温孵育，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗使用前，经过含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液按1:5000‑1:20000的比例稀释处理后，37℃孵育30‑90min；（9）弃液体，加PBST缓冲液至覆盖NC膜，洗膜5‑6次，每次3min，最后一次用PBS缓冲液洗；（10）弃洗脱液，将NC膜用滤纸吸干或静置晾干后，放入能覆盖NC膜的底物显色液TMB中反应，避光静置3‑10min；（11）待NC膜上的阳性对照呈现明显蓝色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应；（12）将已显色的NC膜放入能覆盖NC膜的ddH2O中，漂洗1min后晾干，记录结果并照相保存；（13）检测结果判断：NC膜上的样品呈现蓝色，说明灰飞虱携带水稻条纹病毒；NC膜上的样品未显色时，说明灰飞虱未携带水稻条纹病毒；根据阳性样品数/总样品数计算灰飞虱带毒率。