斑马鱼卵黄原蛋白间接竞争ELISA试剂盒及其检测方法与应用

摘要

斑马鱼卵黄原蛋白间接竞争ELISA试剂盒及其检测方法与应用。通过两步层析与超滤相结合的方法从斑马鱼卵巢与17β-雌二醇暴露后的斑马鱼体内中分别纯化出卵黄脂磷蛋白与卵黄原蛋白，制备兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗体；将斑马鱼卵黄脂磷蛋白纯品、兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗体、空白96孔酶标板1块、以及包被液、洗涤液、封闭液、样品稀释液、显色液、终止液和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗各1支共同装入盒体，得到检测斑马鱼卵黄原蛋白的间接竞争ELISA试剂盒。本发明的试剂盒可以应用于环境类雌激素物质的调查中，能够灵敏、准确、方便的定量检测斑马鱼血浆、整体匀浆液、肝脏组织及肝细胞培养液中的卵黄原蛋白，检测范围为31.25～1000ng mL^-1，为斑马鱼在内分泌干扰物检测领域的应用提供了重要工具。

主权项

一种检测斑马鱼卵黄原蛋白的间接竞争ELISA试剂盒，包括一个盒体，盒体内有空白96孔酶标板1块，封闭液、包被液、洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗各1支，其特征在于该盒体还装有：斑马鱼卵黄脂磷蛋白纯品1支，兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支；所述的斑马鱼卵黄脂磷蛋白制备方法如下：将斑马鱼卵巢取出后称重，加入3倍体积4℃预冷的PBS缓冲液混合，所述的PBS缓冲液内含1mM PMSF且pH 7.4；在冰浴条件下用玻璃匀浆器匀浆，8000g离心10分钟，收集上清液；将上清液进行DEAE‑Sepharose Fast Flow离子交换层析，用分别含0.07M、0.1M、0.2M和1.0M NaCl的25mM Tris‑HCl缓冲液进行不连续洗脱，其中25mM Tris‑HCl缓冲液pH 7.5；收集0.2M洗脱组分，装入截留分子量为100kDa的Millipore超滤离心管，4℃、3000g离心30分钟，加入1ml PBS缓冲液，收集截留在超滤离心管膜上的溶液；取1ml收集液加入Sephadex G‑200层析柱，用pH 7.4的25mM Tris‑HCl缓冲液洗脱，收集第一个主洗脱峰，即为斑马鱼卵黄脂磷蛋白；所述的兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗体的制备方法如下：(1)斑马鱼卵黄原蛋白纯品的制备：采用水体暴露17β‑雌二醇的方式诱导斑马鱼产生卵黄原蛋白，将斑马鱼置于2L的玻璃缸中，每缸放入10尾斑马鱼，17β‑雌二醇的暴露浓度为200μg/L，每天全部换水，并重新加入相应的17β‑雌二醇，早晚投喂饲料，水温26℃；7天后将斑马鱼放入50％的酒精中，待斑马鱼麻醉后，取出称重，并加入3倍体积4℃预冷的PBS缓冲液，所述的PBS缓冲液内含1mM PMSF且pH 7.5，在冰浴条件下用玻璃匀浆器匀浆，4℃、8000g离心10分钟，收集上清液；利用上述的斑马鱼卵黄脂磷蛋白制备方法从上清液中纯化获得斑马鱼卵黄原蛋白；(2)兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗体的制备：取600μg纯化的斑马鱼卵黄原蛋白，加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化后对新西兰大白兔进行背部皮下多点注射，每点注射0.1ml，两周后再次加强免疫，免疫剂量为600μg/只，用弗氏不完全佐剂充分乳化后进行背部皮下注射，此后，每隔10天按以上方法进行加强免疫；第5次注射后于第5天从心脏取血，6000r/min离心20分钟，收集上清，获得了兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清；抗体的纯化分为以下几步，上样前向多克隆抗血清中加入1/3的雄鱼匀浆液，低温振荡2h，4℃过夜，次日离心取上清；向上清中加入等体积的PBS缓冲液；在冰浴条件下加入等体积饱和硫酸铵，0℃震荡2h后，8000rpm低温离心15min，弃上清，沉淀用10ml PBS缓冲液溶解；用0.45微米孔径的滤膜过滤后，上Hitrap Protein G柱，以PBS缓冲液洗脱10个柱体积后，用pH 2.7的0.1M甘氨酸洗脱，即获得兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗体。