一种在大肠杆菌中一步法合成DNA片段并组装合成基因的方法

摘要

本发明提出了一种在大肠杆菌中一步法合成DNA片段并组装合成基因的方法，主要步骤包括：构建LIC载体质粒LIC-A；制备LIC-A线性载体；构建组装DNA片段的受体载体puc-Kana；选择目标基因，划分300bp左右的小片段进行合成；多个小片段DNA利用金门克隆反应组装成大片段基因。本发明操作简单，无需再重复做克隆和测序的操作，直接退火，克隆效率高，使用了发光报告基因sfgfp、gfp，筛选方法直观，合成方法的错误率很低，合成基因的周期短，大大节约了成本，节约了时间。本发明适用于各种基因的合成，对于大基因的合成特别有效。

主权项

一种在大肠杆菌中一步法合成DNA片段并组装合成基因的方法，其特征在于具体步骤为：1)、构建LIC载体LIC‑A以商品化的pet23a和pLP‑VSVG载体用常规方法构建T7‑sfgfp质粒，以sfgfp‑PF/PBR–PR、T7‑sfgfp质粒为模板，通过PCR扩增得到线性载体骨架LIC；设计SPC‑PF/SPC‑PR为两对引物，以T7‑sfgfp为模板，通过PCR扩增得到SPC盒式结构；扩增好的SPC盒式结构的两端都带上了一个限制性酶切位点BciVI和13bp的片段填充序列和T7启动子下游的10个碱基的序列；其次，在载体骨架LIC和SPC盒式结构两端引入20bp的同源序列，扩增获得的SPC盒式结构，通过无酶克隆的方式克隆到载体骨架LIC上；经过限制性内切酶酶切和测序鉴定得到正确的LIC‑A载体质粒；2)、LIC‑A线性载体的制备把测序正确的LIC‑A质粒先用限制性内切酶BciVI在37℃酶切，并凝胶回收后的产物，然后再用T4DNA聚合酶3次分别在加dGTP、dCTP、dTTP的保护下12℃利用T4DNA聚合酶消化30min，溶液回收后备用，这样处理的载体在其3’端各突出13nt；3)、构建组装DNA片段的受体载体puc‑Kana首先，以PBR322‑PF/PBR322‑PR为引物，以商品化的puc‑19质粒为模板，通过PCR扩增获得线性骨架载体片段PBR322；以gfp‑PF/gfp‑PR为引物，以pGSilG‑Lic为模板，通过PCR获得两端带有BspQI酶切位点和EarI酶切位点的gfp盒式结构；以Kana‑PF/Kana‑PR为引物，以pGSilG‑Lic为模板通过PCR扩增，获得Kana盒式结构；其次，通过重叠延伸PCR将gfp盒式结构和Kana盒式结构拼接成gfp‑Kana单元；最后，将gfp‑Kana单元和线性骨架载体片段PBR322进行1:3混合通过无酶克隆方式转化大肠杆菌XL‑Gold进行克隆；挑取在蓝光仪下发绿光的菌落，通过质粒电泳、质粒酶切鉴定和质粒测序方式得到了正确的大小为3686bp的puc‑Kana质粒；4)、选择目标基因，划分300bp左右的小片段进行合成先选择确定目标基因XY，将需要合成的目标基因的DNA序列按照每300bp左右进行划分为G1、G2、G3、G4、G5……Gn多个小片段，分别设计彼此重叠17bp左右且无缝的引物序列对，每个300bp左右的片段需要合成12条长度为40‑45nt的寡核苷酸引物；再分别将合成好的12条寡核苷酸序列稀释成终浓度10μM，然后分别取0.5μL至一PCR管内，加2ul的LA Taq Buffer，最后加双蒸水至终体积20μL混合；分别让其按照94℃5min，94℃→37℃slope 20min，37℃7min的逐步降温的程序退火，且首尾两条引物的5’端分别引入13nt与线性载体同源互补的序列；将步骤2)准备好的线性载体与退火形成的小DNA片段混合，37℃放置30min后转化大肠杆菌感受态细胞，通过重构T7启动子启动下游报告基因sfgfp的表达，将筛选后测序正确重组子分别命名为XYG1、XYG2、XYG3、XYG4、XYG5……XYGn；5)、多个小片段DNA组装成大片段基因要合成大于300bp以上的DNA片段，需要用步骤4的XYG1、XYG2、XYG3、XYG4、XYG5……XYGn质粒作为供体质粒，再另加切好的受体载体质粒puc‑Kana做金门克隆反应，这样就合成了与目标基因相同的合成基因。