一种荧光滴定测定单抗活性位点浓度的方法

摘要

一种荧光滴定测定单抗活性位点浓度的方法，以340nm附近为激发峰且280nm为激发谷的荧光团为色氨酸FRET接受体，用非荧光半抗原、无色氨酸抗原表位为非荧光探针，非荧光探针与色氨酸FRET接受体加合物、色氨酸FRET接受体类半抗原为荧光探针；探针与纯单抗反应，280nm激发测定340nm荧光或色氨酸FRET接受体荧光得滴定曲线；基于可逆反应、探针静态和动态猝灭、荧光信号加和，建立荧光信号变化数学模型拟合滴定曲线确定单抗位点浓度。分析340nm信号变化时，用不收敛但拟合决定系数高于0.99参数计算信号变化一阶导数最大值为单抗340nm信号响应曲线斜率，再拟合相同滴定曲线得单抗位点浓度。

主权项

一种荧光滴定测定单抗活性位点浓度的方法，其特征如下：(一)所适用单抗有较高纯度，能识别非荧光半抗原、缺乏色氨酸的连续抗原表位、激发峰在340nm附近而在280nm附近为激发谷的荧光半抗原，且不含有其它抗体或蛋白；(二)所用滴定探针包括荧光探针和非荧光探针两类；非荧光探针为单抗所识别的非荧光半抗原、缺乏色氨酸连续抗原表位；激发峰在340nm附近且在280nm附近为激发谷的荧光团称色氨酸FRET接受体，对应荧光探针为色氨酸FRET接受体类荧光半抗原、上述非荧光探针与色氨酸FRET接受体荧光团的加合物；(三)用滴定探针测定对应单抗的荧光滴定曲线；此滴定曲线测定过程的特征如下：(1)取一定量中性磷酸盐缓冲液至荧光比色杯中，加入一定量单克隆抗体样品溶液混合均匀：用总容量为4.0ml的荧光比色杯时，混匀后液体总体积在2.0ml以上；用微量荧光比色杯时，混匀后液体总体积达到荧光分光光度计测定所含液体荧光信号的要求；(2)准确称量所选滴定探针，用相同中性缓冲液直接溶解并稀释至不低于20μM，有强吸收探针用吸收标定浓度；或用二甲亚砜、二甲基甲酰胺为溶剂配制成浓度不低于2.0mM储备液，再用相同中性缓冲液稀释到20μM；滴定使用之前再稀释到2.0μM或所需浓度；(3)取5～20μL探针溶液加入荧光比色杯内单抗溶液中，温和摇匀后静置反应3～10分钟；用非荧光探针滴定时，280nm激发测定340nm荧光信号；用荧光探针时280nm激发测定340nm荧光信号或荧光探针自身特有发射峰下荧光信号；用丹磺酰胺为色氨酸FRET接受体时，测定在540nm附近荧光信号；荧光信号稳定后记录在所选波长下的荧光信号；(4)继续取5～20μL探针溶液加入相同荧光比色杯内含待测单抗的溶液中，温和摇匀，静置3～10分钟后测定所选波长下的稳定荧光信号；重复操作到加入探针后所测荧光信号相对变化小于1％或滴定探针累积浓度达到据其蛋白量换算所得抗体活性位点浓度10倍；(5)按照信号和各种物质的浓度成正比的原则，校正加入的滴定探针溶液对单抗起始浓度C₀的稀释效应、对荧光信号的降低效应；(四)用Matlab软件或自编程序，按如下公式拟合滴定曲线测定单抗的位点浓度：(1)定义如下的变量和符号：C_x：滴定探针和单抗的复合物的浓度；C₀：为单抗的位点浓度；K_d：探针与单抗的解离常数；x：滴定探针的总浓度；F：测量波长下的总荧光信号；S₁：游离单抗的荧光信号响应系数；Ksv：滴定探针的动态猝灭常数；S₂：探针和单抗复合物的荧光信号响应系数；F_b：杂蛋白及其它物质的荧光信号；S₃：游离探针的荧光信号响应系数；(2)据探针和单抗可逆结合平衡、各成分荧光信号线性相加、考虑动态及静态猝灭得：$C_x=\frac{(C_0+x+K_d)-\sqrt{{(C_0+x+K_d)}^2-4\times C_0\times x}}{2}---\left(1\right)$$\begin{array}{c}F=\frac{S_1\times (C_0-C_x)}{1+Ksv\times (x-C_x)}+\frac{S_2\times C_x}{1+Ksv\times (x-C_x)}\\ +S_3\times (x-C_x)+\frac{F_b}{1+Ksv\times (x-C_x)}\end{array}---\left(2\right)$(3)当测定荧光探针特有发射信号时确定滴定反应体系的单抗起始浓度C₀有两种方法：(a)选择滴定曲线起始阶段的数据得到针对初始滴定数据的渐近线；选择接近饱和结合的数据得到探针饱和结合后的渐近线；两条渐近线延长线的交点在横坐标轴上对应的探针总浓度，是滴定反应体系单抗起始浓度C₀的近似值；(b)实验测定S₃，用Equ.(2)拟合滴定曲线得到最优拟合对应的C₀为所需参数；(4)测点单抗340nm荧光信号时起始信号等于(C₀×S₁+F_b)，即F_b与C₀、S₁之间有协方差，这使得用Equ.(2)拟合滴定曲线时拟合不收敛；用如下拟合策略可消除此协方差：(a)先用Equ.(2)拟合某条滴定曲线获得决定系数高于0.99的拟合方程；从拟合方程推算其一阶导数；以一阶导数的最大值，即x趋近于零时的一阶导数，作为S₁的近似值；(b)设定F_b为零，并将S₁固定在其近似值，再用Equ.(2)拟合相同的滴定曲线，获得对应最佳拟合的唯一C₀作为待测单抗的起始位点浓度。