一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法

摘要

本发明公开了一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，包括如下步骤：材料准备、枝条嫁接、提取总RNA、miRNA文库构建和小RNA Solexa测序分析。本发明一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，通过对山核桃中三个小RNA文库的数据进行生物信息学分析能够确认21个保守miRNA是属于13个miRNA家族，而10个新miRNA和8个潜在的新miRNA是属于15个miRNA家族。通过分析发现，保守miRNA在山核桃嫁接过程中都具有明显的差异性，并且2/3都是下调的。同样利用qRT-PCR对14个miRNA进行表达分析，发现表达的趋势与Solexa测序数据分析结果相吻合。另外还预测了保守miRNA基因的89个靶基因和新的miRNA基因的26个靶基因，对山核桃的嫁接理论知识有进一步指导作用，能更好的在山核桃高产、高效、生态和安全实践中指导生产。

主权项

一种山核桃嫁接过程中小RNA测序分析方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一、材料准备：选取山核桃的嫁接枝条，选取砧木为两年生的实生苗，而接穗则是留有一个健壮芽的大概约9cm左右长的一年生的苗，采取后迅速用锡箔纸包好放入液氮罐，存放‑70℃环境中备用；步骤二、枝条嫁接：将经过步骤一选取的山核桃砧木和接穗进行嫁接；步骤三、提取总RNA：山核桃完成嫁接后，在0、7、14天对山核桃茎进行采样，将采集的样品迅速用锡箔纸包好放入液氮罐，存放‑70℃环境中备用，并提取样品的总RNA，总RNA的提取步骤如下：1)在10ml离心管里面加入0.2ml的β‑巯基乙醇和4mlCTAB，然后放入65℃的水浴锅中预热；2)在样品中加入适量的PVP然后用预冷好的研棒磨细，分装在已经预热的离心管里面，每一管大约4药匙然后利用涡旋仪混匀，然后将离心管放入65℃水浴锅中加热，期间不时上下颠倒混匀加热30min，混合均匀后4℃，12000rpm，离心10min；3)将离心后的上清液转入新的10ml离心管里面，再加入等体积的24:1的氯仿：异戊醇上下颠倒混匀后4℃，12000rpm，离心10min；4)重复第三步，直至中间层消失；5)将离心后的上清液转入新的10ml离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后在‑20℃冰箱中静置30min～1h；6)将冷冻的离心管在4℃，12000rpm，离心10min，离心完成后将液体倒掉；7)在沉淀中加入600ul裂解液RTL Plus，4℃，13000rpm，离心30s，收集上清液，然后加入0.5倍体积的无水乙醇，吹打混匀；8)将混合物加入到吸附柱RA中，4℃，13000rpm，离心30s，将废液倒掉；9)在吸附柱中加入750ul的去蛋白液RW1，在室温下放置1min，13000rpm离心30s，将废液倒掉；10)加入600ul的漂洗液RW，13000rpm，离心30s，将废液倒掉，重复一遍；11)将吸附柱RA放回到一个新的收集管里面，13000rpm，离心2min，尽可能的去除漂洗液；12)将吸附柱AP放到一个干净灭菌离心管里面，并在吸附膜的中间部位加40ul ddH2O，室温下放置1min，12000rpm，离心1min，获得溶解好的RNA；步骤四、miRNA文库构建：将经过步骤三提取的三个时期的总RNA样本分别标记为G0、G7、G14，G0设为对照组，miRNA文库的构建具体过程如下：1)先用1％琼脂糖的凝胶电泳与紫外分光光度计来检测RNA质量，用Aligent2100RNA 6000Nano Kit来检测RNA整齐度；2)接着用15％的聚丙烯酰胺的变性凝胶来分离开小分子RNA，再用小片段RNA回收的试剂盒来回收并且纯化长度为18～30bp之间的RNA，连接5’和3’接头来进行反转录合成；3)最终进行PCR扩增，并且构建这些小分子RNA的cDNA文库；步骤五、小RNA Solexa测序分析：用Illumina HiSeqTM 2000平台来进行测序分析，预测分析包括保守miRNA和新的miRNA序列预测及分析、山核桃miRNA差异表达分析和miRNA与靶基因qRT‑PCR检测。