一种灵菌红素的提取分离方法

摘要

本发明公开了一种灵菌红素的提取分离方法，该灵菌红素的提取分离方法包括：选取实验室优化的菌种，经斜面活化后接入种子培养基，进行发酵培养；提取灵菌红素：取发酵液，离心，加入适量酸性丙酮，超声提取，用旋转蒸发器旋转蒸干得到丙酮粗提物，用石油醚进行脱酯；利用薄层层析的方法来进行硅胶柱层析前的预实验，通过改变配比进行多次试验，得到最好的溶剂配比；进行柱层析；进行二次柱层析分离纯化。本发明的先离心，去掉含灵菌红素较少的上清液，用酸性丙酮对菌体进行粗提取，选择常用的硅胶柱层析来进行精分离，采用氯仿-乙酸乙酯溶剂系统和氯仿-乙酸乙酯-甲醇的溶剂系统梯度洗脱，分离得到灵菌红素及未知物质，分离纯度高。

主权项

一种灵菌红素的提取分离方法，其特征在于，所述的灵菌红素的提取分离方法包括以下步骤：步骤一、选取实验室优化的菌种，经斜面活化后接入种子培养基，进行发酵培养；步骤二、提取灵菌红素：取发酵液，离心，加入酸性丙酮，超声提取，用旋转蒸发器旋转蒸干得到丙酮粗提物，用石油醚进行脱酯；步骤三、利用薄层层析的方法来进行硅胶柱层析前的预实验，通过改变配比进行多次试验，得到最好的溶剂配比；步骤四、进行柱层析；步骤五、进行二次柱层析分离纯化；步骤一所述的发酵培养的具体方法为：选取实验室优化的菌种，经斜面活化后接入种子培养基，37℃，180r/min的摇床培养12h；种子培养基：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl5.0g/L，琼脂18.0g/L，pH：7.4～7.6；随后发酵培养，250mL三角瓶，装液量50mL，按5％的接种量接种至发酵培养基中，37℃，180r/min的摇床培养48h；发酵培养基：甘油20.0g/L，蛋白胨13.0g/L，MgSO₄1.2g/L，NaCl5.0g/L，摇瓶装液量20mL/100mL，接种量5％V/V，pH：6.5；步骤二所述的提取灵菌红素的具体方法为：取发酵液，10000rmp下离心10min，加入适量pH＝3.0的酸性丙酮，25℃下，超声提取20min，提取三次至菌体无色，随后用旋转蒸发器60℃旋转蒸干得到丙酮粗提物，回收丙酮还能重复利用，由于之前用丙酮粗提物上柱得到的灵菌红素干燥后成油脂状，无法干燥，所以用石油醚进行脱酯，重复三次，称量；步骤三所述的预实验，在氯仿‑乙酸乙酯的溶剂系统上加入甲醇来加大极性，采用氯仿‑乙酸乙酯‑甲醇的溶剂系统；步骤四所述的柱层析的具体方法如下：装柱:柱层析中吸附剂的填充量应占柱子体积的1/4‑1/5，采取湿法上柱，操作如下：(1)将称量的硅胶加入烧杯中，倒入选定极性的洗脱剂，使硅胶完全浸入溶液中；(2)用超声波清洗机，边超声震荡边用玻璃棒搅拌，打散硅胶团，赶出气泡；(3)预先往硅胶柱中加少量溶剂，然后在搅拌下缓缓将硅胶倒入柱中；(4)静置直至硅胶层不再降低，排除多余溶剂，计算主留体积；(5)在硅胶上垫一层滤纸，防止加溶剂时将上层硅胶冲起；(6)测量高径比；加样:在超声震荡下用少量洗脱剂溶解样品，用滴管将样液缓缓沿壁均匀加入到柱体上面，最后用溶剂对主壁清洗2次～3次；洗脱:用找到的最优洗脱剂溶剂洗脱，在洗脱过程中，不能使层面扰动，尤其是开始阶段，洗脱速度控制在每分钟流出为柱体积1/200，对于不同颜色的条带分开接收，接收用的玻璃仪器必须干净、干燥，当用第一种洗脱剂无法洗脱下物质时，用之后确定的加大极性后的展开剂进行洗脱；薄层层析检测:薄层层析检测，只有斑点的则初步认定为较纯组分，根据Rf值大小来确定成分是否相同，成分相同的则将收集液合并后旋转蒸发进行浓缩，交叉部分单独收集。