一种利用复合诱变剂诱导杂交兰多倍体植株的方法

摘要

本发明公开一种利用复合诱变剂诱导杂交兰多倍体植株的方法，经过化学诱变剂的配制、材料的选择处理、根状茎的分化培养、变异植株形态鉴定、气孔鉴定、染色体鉴定、继代培养，最终确定为杂交兰多倍体植株。本发明提高杂交兰的诱变率，多倍体诱变率平均提高10～20%、最高死亡率为10%、嵌合率降低10%。本发明减少嵌合体形成，提高多倍体的变异率，继代三代以后多倍体稳定，缩短鉴别时间的优势。本发明能够提高多倍体的变异率，减轻对植物的伤害，提高变异苗的成活率。安磺灵和EMS的使用剂量少，能减少化学药物的毒害，降低成本。并能有效减少嵌合体的形成，降低成本。

主权项

一种利用复合诱变剂诱导杂交兰多倍体植株的方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）化学诱变剂的配制：配制质量浓度为0.001～0.003%的安磺灵溶液；（2）处理材料的选择处理：杂交兰按常规茎尖诱导形成根状茎培养1月后，选择大小、部位一致的幼嫩根状茎尖端，切下1cm，浸泡在步骤（1）所得安磺灵溶液中，浸泡时间为24～72小时，然后用灭菌蒸馏水清洗3次，用灭菌滤纸吸干水分，再接种到下列培养基中：MS+EMS20～70mg/L+6‑BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蛋白胨2g/L+蔗糖25g/L+香蕉100g/L+活性炭3g/L+琼脂7g/L，pH值为5.4～5.8；并在温度25±1℃、光照强度1000～2000lx、光照12h/d的条件下进行无菌培养一个月；（3）根状茎的分化培养：将步骤（2）培养后的根状茎转接到下列培养基中：MS+6‑BA 5mg/L +NAA 1mg/L+蛋白胨 2g/L+蔗糖 25g/L+香蕉 100g/L+活性炭 3g/L+花宝1号 2.5g/L+花宝2号 0.6g/L+花宝5号 0.8g/L+琼脂 7g/L，pH值为5.4～5.8；并在温度25±1℃、光照强度1000～2000lx、光照12h/d的条件下进行分化培养，直到根状茎形成组培苗，并长出幼嫩根；（4）变异植株形态鉴定：挑选步骤（3）所得组培苗中植株器官巨大、叶色浓绿、叶片宽大肥厚、叶片卷曲、生长缓慢的根状茎，即得到疑似多倍体植株；（5）将步骤（4）所得疑似多倍体植株进行下列气孔鉴定；取疑似多倍体植株的叶下表皮，用光学显微镜观察气孔，当气孔直径增大0.5～1倍、单位面积内的气孔数明显减少、且保卫细胞内叶绿体大且颜色较深的，即初步判断为多倍体变异植株；同一表皮上气孔大小差异显著的，即初步判断为嵌合体植株；（6）将步骤（5）所得多倍体变异植株和嵌合体植株进行下列染色体鉴定：在上午9点到12点，细胞分裂旺盛时期，分别取步骤（5）所得多倍体变异植株和嵌合体植株的幼嫩根根尖1～1.5cm，用质量浓度为0.1%的秋水仙素浸泡4h后，清洗，再用卡诺固定液固定20～24h后，清洗，然后用浓度为1mol/L的盐酸在60℃下解离8～10min，清洗，再用卡宝品红染色3～5min，压片，在光学显微镜下观察染色体，选出四倍体植株和嵌合体植株；（7）将步骤（6）所得四倍体植株进行继代培养三次，每次继代培养后均进行染色体鉴定一次，三次鉴定均为四倍体植株的，确定为杂交兰多倍体植株；（8）将步骤（6）所得嵌合体植株进行继代培养三次，每次继代培养后均进行染色体鉴定一次，鉴定为四倍体植株的继续完成剩余继代培养和鉴定，鉴定为二倍体植株的弃之，鉴定仍为嵌合体植株的经稳定培养，确定为杂交兰多倍体植株。