一种利用连续合并上清的方式提取草莓成熟果实RNA的方法

摘要

本发明提供一种利用连续合并上清的方法提取草莓成熟果实RNA，涉及分子生物学技术领域，通过前处理、合并上清液、沉淀大分子量的RNA、抑制多酚氧化、去除多糖、抑制RNase酶的活性等操作，再经紫外—可见分光光度计、电泳分析，本发明提取成熟草莓果实中的RNA的方法稳定性好，耗费成本低，提取的RNA纯度和含量较高，可满足PCR、Northern杂交、转录组测序等分子生物学的研究需要。

主权项

一种利用连续合并上清的方式提取草莓成熟果实RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、前处理：在液氮环境下，将成熟草莓果实迅速研磨成粉末，取8个1.5ml离心管，将研磨粉末迅速加至符合预热标准的CTAB缓冲液，然后按每毫升缓冲液加13～15μlβ‑巯基乙醇的标准加入缓冲液，涡旋震荡80～100s后，置于60～65℃水浴锅水浴30～40min，每10min取出一次，轻摇；S2、分别在8个离心管中，加入等体积氯仿和异戊醇的混合液，用力摇动110～130s，使溶液充分混合并形成乳液，再在3～6℃环境下，离心12～16min，收集上清液，将8个离心管上清合并后平均分到6个离心管中，再加入80％‑90％体积的氯仿和异戊醇的混合物，摇动110～130s；S3、将步骤S2处理后的6个离心管在3～6℃环境下，离心12～16min，取上清液，将其合并后平均分到4个离心管中，加入LiCl溶液沉淀RNA，在3～6℃环境下，沉淀8‑15h；S4、将步骤S3处理后的4个离心管在3～6℃环境下，离心18～22min，弃上清液，用0.4～0.7ml的0.5％SDS充分溶解沉淀物，将4个离心管中的溶解液合并到2个离心管中，然后，加入等体积氯仿和异戊醇的混合物，摇匀，再在3～6℃环境下，离心10min，取上清液；S5、将步骤S4得到2个离心管中的上清液合并，加入3M NaAc和3倍体积无水乙醇调节上清液浓度和pH，再将其在–65～–80℃环境下沉淀40min；S6、再将步骤S5沉淀后的溶液，在3～6℃环境下，离心20min，弃上清液，沉淀用75％的乙醇重复洗涤2～3次以除去多糖的污染，再在4℃离心15min；S7、将步骤S6离心后的溶液弃上清，凉干沉淀，用50μl DEPC灭菌水溶解RNA，置于‑80℃环境下保存。