利用粗毛韧革菌菌体作为催化剂制备银杏内酯B的方法

摘要

本发明公开了利用粗毛韧革菌(Stereum hirsutum)菌体作为催化剂转化银杏内酯混合物合成银杏内酯B的方法，属于生物技术领域。本发明通过对粗毛韧革菌菌种进行扩大培养，从试管斜面、液体摇瓶、种子培养和菌体分离，利用菌体作为催化剂，转化银杏内酯合成银杏内酯B，转化液经过离心、乙酸乙酯萃取、无水酒精结晶把银杏内酯B从发酵液分离出来。利用该方法所得到的银杏内酯B的纯度≥99％，银杏内酯转化率＞90％。

主权项

粗毛韧革菌转化银杏内酯生产银杏内酯B的方法，其特征在于以粗毛韧革菌为出发菌株，通过试管斜面培养、液体摇瓶培养、种子罐培养、离心获得菌体，菌体催化银杏内酯合成含有银杏内酯B的反应液，含有银杏内酯B的反应液经过离心、乙酸乙酯萃取、浓缩、酒精复溶，‑20℃结晶、过滤、烘干提取工艺得到银杏内酯B晶体；所述的粗毛韧革菌菌种为从云南、山西和西藏的任意一种金耳子实体中分离出的金耳伴生菌菌种；所述液体摇瓶培养的种子培养基组成单位以克/升计：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～20，KH₂PO₄ 1～6，MgSO₄ 1～4，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0，100～140℃灭菌20～60分钟；其中所述的种子罐培养的培养基组成单位以克/升计：葡萄糖5～40，玉米粉5～25，蛋白胨1～10，KH₂PO₄ 1～6，MgSO₄ 1～4，消泡剂0.1～0.8，加水至适当体积，起始pH值为5.0～8.0，100～140℃灭菌20～60分钟；转化银杏内酯反应液组成单位以克/升计：银杏内酯10～50，起始pH值为5.0～8.0；液体摇瓶培养的培养条件是：250mL三角瓶装液量为60～150mL，接种3～4块4×4mm小块菌种，置于温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间24～48小时；种子罐培养的培养条件是：接种量以种子液体积/接种后体积计为5～10％，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1：0.3～1v/v/m，培养时间80～90小时；所述转化银杏内酯的工艺条件是：种子液4000～6000转/分钟，离心5～20分钟，收集菌体，菌体与反应液按重量：体积为1:5～50混匀，在温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1:0.3～1v/v/m，转化6～18小时；按照该转化工艺，其中在进行摇瓶培养之前，首先将粗毛韧革菌的斜面菌种接入新配制的马铃薯葡萄糖培养基中进行传代培养，培养温度22～30℃，培养时间24～248小时。