腈水合酶突变体

摘要

本发明提供了腈水合酶突变体，本发明的腈水合酶突变体包含至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代，通过1个氨基酸取代而改善腈水合酶的2个以上的性质。

主权项

一种腈水合酶突变体，其特征在于，包含至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代，所述取代通过3个以下1个以上的氨基酸取代而改善腈水合酶的2个以上的性质，所述被改善的性质为反应初速度及热稳定性，所述腈水合酶突变体含有序列表的序列号1表示的α亚单位和序列表的序列号2表示的β亚单位，并且下述(1)～(21)中的任意项所示的突变位点被取代为其它氨基酸：(1)α亚单位的第94位；(2)α亚单位的第197位；(3)β亚单位的第4位；(4)β亚单位的第79位；(5)β亚单位的第96位；(6)β亚单位的第107位；(7)β亚单位的第226位；(8)α亚单位的第13位、及α亚单位的第94位；(9)α亚单位的第13位、及β亚单位的第96位；(10)α亚单位的第27位、及α亚单位的第94位；(11)α亚单位的第27位、及β亚单位的第107位；(12)β亚单位的第4位、及β亚单位的第79位；(13)β亚单位的第79位、及β亚单位的第230位；(14)β亚单位的第110位、及β亚单位的第231位；(15)β亚单位的第206位、及β亚单位的第230位；(16)α亚单位的第13位、α亚单位的第27位及β亚单位的第110位；(17)α亚单位的第13位、β亚单位的第206位、及β亚单位的第226位；(18)α亚单位的第197位、β亚单位的第107位、及β亚单位的第230位；(19)β亚单位的第79位、β亚单位的第230位、及β亚单位的第231位；(20)α亚单位的第197位、及β亚单位的第24和107位；(21)β亚单位的第24位、及β亚单位的第79位；所述(1)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第94位被取代为Ile，并且，还包含下述(a)、(b)或(c)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(a)β亚单位的第37、108和200位，(b)α亚单位的第6、19和126位、及β亚单位的46、108和212位，(c)β亚单位的第61和150位，所述(a)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第37位被取代为Val，β亚单位的第108位被取代为Asp，及β亚单位的第200位被取代为Glu，所述(b)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第6位被取代为Thr，α亚单位的第19位被取代为Val，α亚单位的第126位被取代为Tyr，β亚单位的第46位被取代为Lys，β亚单位的第108位被取代为Arg，及β亚单位的第212位被取代为Tyr，所述(c)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第61位被取代为Gly，及β亚单位的第150位被取代为Asn；所述(2)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第197位被取代为Cys，并且，还包含下述(d)、(e)或(f)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(d)β亚单位的第48、108和212位，(e)β亚单位的第40和218位，(f)β亚单位的第160和168位，所述(d)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第48位被取代为Val，β亚单位的第108位被取代为Arg，及β亚单位的第212位被取代为Tyr，所述(e)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第40位被取代为Val，及β亚单位的第218位被取代为Met，所述(f)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第160位被取代为Cys，及β亚单位的第168位被取代为Glu，所述(3)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第4位被取代为Met，并且，还包含下述(g)、(h)或(i)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(g)α亚单位的第6、19和126位、及β亚单位的第127、160和186位，(h)α亚单位的第36和188位，(i)β亚单位的第176和217位，所述(g)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第6位被取代为Ala，α亚单位的第19位被取代为Val，α亚单位的第126位被取代为Tyr，β亚单位的第127位被取代为Ser，β亚单位的第160位被取代为Trp，及β亚单位的第186位被取代为Arg，所述(h)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第36位被取代为Gly，及α亚单位的第188位被取代为Gly，所述(i)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第176位被取代为Ala，及β亚单位的第217位被取代为Val，所述(4)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第79位被取代为Asn，并且，还包含下述(j)、(k)或(l)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(j)α亚单位的第19、71和126位、及β亚单位的第37、108和200位，(k)β亚单位的第33和176位，(l)β亚单位的第61和150位，所述(j)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第19位被取代为Val，α亚单位的第71位被取代为His，α亚单位的第126位被取代为Tyr，β亚单位的第37位被取代为Val，β亚单位的第108位被取代为Asp，及β亚单位的第200位被取代为Glu，所述(k)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第33位被取代为Met，及β亚单位的第176位被取代为Thr，所述(l)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第61位被取代为Gly，及β亚单位的第150位被取代为Asn，所述(5)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第96位被取代为Arg，并且，还包含下述(m)、(n)或(o)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(m)α亚单位的第36和126位，(n)α亚单位的第36、148和204位，(o)α亚单位的第6、19和126位、及β亚单位的第48、108和212位，所述(m)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第36位被取代为Met，及α亚单位的第126位被取代为Tyr，所述(n)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第36位被取代为Met，及α亚单位的第148位被取代为Asp，及α亚单位的第204位被取代为Arg，所述(o)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第6位被取代为Thr，α亚单位的第19位被取代为Val，α亚单位的第126位被取代为Tyr，β亚单位的第48位被取代为Val，β亚单位的第108位被取代为Arg，及β亚单位的第212位被取代为Tyr，所述(6)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第107位被取代为Met，并且，还包含下述(p)、(q)或(r)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(p)β亚单位的第160和186位，(q)α亚单位的第19、71和126位、及β亚单位的第37、108和200位，(r)β亚单位的第61和217位，所述(p)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第160位被取代为Trp，及β亚单位的第186位被取代为Arg，所述(q)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第19位被取代为Val，α亚单位的第71位被取代为His，α亚单位的第126位被取代为Tyr，β亚单位的第37位被取代为Val，β亚单位的第108位被取代为Asp，及β亚单位的第200位被取代为Glu，所述(r)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第61位被取代为Trp，及β亚单位的第217位被取代为His，所述(7)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第226位被取代为Ile，并且，还包含下述(s)、(t)或(u)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(s)α亚单位的第36和126位，(t)β亚单位的第37、108和200位，(u)β亚单位的第40和218位，所述(s)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第36位被取代为Met，及α亚单位的第126位被取代为Tyr，所述(t)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第37位被取代为Val，β亚单位的第108位被取代为Asp，及β亚单位的第200位被取代为Glu，所述(u)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第40位被取代为Val，及β亚单位的第218位被取代为Met，所述(8)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第13位被取代为Leu，及α亚单位的第94位被取代为Ile，并且，还包含下述(v)、(w)或(x)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(v)α亚单位的第6、36和126位，(w)β亚单位的第61和160位，(x)β亚单位的112和217位，所述(v)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第6位被取代为Thr，及α亚单位的第36位被取代为Met，及α亚单位的第126位被取代为Tyr，所述(w)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第61位被取代为Ser，及β亚单位的第160位被取代为Met，所述(x)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第112位被取代为Val，及β亚单位的第217位被取代为Met，所述(9)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第13位被取代为Leu，及β亚单位的第96位被取代为Arg，并且，还包含下述(y)、(z)或(aa)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(y)β亚单位的第46、108和212位，(z)α亚单位的第19、71和126位、及β亚单位的第37、108和200位，(aa)α亚单位的第36和48位，所述(y)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第46位被取代为Lys，β亚单位的第108位被取代为Arg，及β亚单位的第212位被取代为Tyr，所述(z)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第19位被取代为Val，α亚单位的第71位被取代为His，α亚单位的第126位被取代为Tyr，β亚单位的第37位被取代为Leu，β亚单位的第108位被取代为Asp，及β亚单位的第200位被取代为Glu，所述(aa)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第36位被取代为Ala，及α亚单位的第48位被取代为Gln，所述(10)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第27位被取代为Ile，及α亚单位的第94位被取代为Ile，并且，还包含下述(ab)、(ac)或(ad)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(ab)α亚单位的第6、36和126位，(ac)β亚单位的第127、160和186位，(ad)α亚单位的第36和188位，所述(ab)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第6位被取代为Thr，α亚单位的第36位被取代为Met，及α亚单位的第126位被取代为Tyr，所述(ac)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第127位被取代为Ser，β亚单位的第160位被取代为Trp，及β亚单位的第186位被取代为Arg，所述(ad)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第36位被取代为Gly，及α亚单位的第188位被取代为Gly，所述(11)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第27位被取代为Ile，及β亚单位的第107位被取代为Met，并且，还包含下述(ae)、(af)或(ag)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(ae)β亚单位的第37、108和200位，(af)α亚单位的第6、36和126位、及β亚单位的第10、118和200位，(ag)β亚单位的第176和217位，所述(ae)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第37位被取代为Leu，β亚单位的第108位被取代为Asp，及β亚单位的第200位被取代为Glu，所述(af)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第6位被取代为Thr，α亚单位的第36位被取代为Met，α亚单位的第126位被取代为Tyr，β亚单位的第10位被取代为Asp，β亚单位的第118位被取代为Val，及β亚单位的第200位被取代为Glu，所述(ag)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第176位被取代为Met，及β亚单位的第217位被取代为Gly，所述(12)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第4位被取代为Met，及β亚单位的第79位被取代为Asn，并且，还包含下述(ah)、(ai)或(aj)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(ah)β亚单位的第48、108和212位，(ai)β亚单位的第61和218位，(aj)β亚单位的第146和217位，所述(ah)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第48位被取代为Val，β亚单位的第108位被取代为Arg，及β亚单位的第212位被取代为Tyr，所述(ai)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第61位被取代为Thr，及β亚单位的第218位被取代为Ser，所述(aj)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第146位被取代为Gly，及β亚单位的第217位被取代为Ser，所述(13)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第79位被取代为Asn，及β亚单位的第230位被取代为Glu，并且，还包含下述(ak)、(al)或(am)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(ak)α亚单位的第19、71和126位，(al)β亚单位的第10、118和200位，(am)α亚单位的第6、19和126位，及β亚单位的第48、108和211位，所述(ak)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第19位被取代为Val，α亚单位的第71位被取代为His，及α亚单位的第126位被取代为Tyr，所述(al)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第10位被取代为Asp，β亚单位的第118位被取代为Val，及β亚单位的第200位被取代为Glu，所述(am)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第6位被取代为Thr，α亚单位的第19位被取代为Val，α亚单位的第126位被取代为Tyr，β亚单位的第48位被取代为Val，β亚单位的第108位被取代为Arg，及β亚单位的第211位被取代为Tyr，所述(14)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第110位被取代为Asn，及β亚单位的第231位被取代为Val，并且，还包含下述(an)、(ao)或(ap)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(an)β亚单位的第118和200位，(ao)β亚单位的第37、108和200位，(ap)β亚单位的第40和217位，所述(an)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第118位被取代为Val，及β亚单位的第200位被取代为Glu，所述(ao)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第37位被取代为Leu，β亚单位的第108位被取代为Asp，及β亚单位的第200位被取代为Glu，所述(ap)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第40位被取代为Leu，及β亚单位的第217位被取代为Leu，所述(15)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第206位被取代为Leu，及β亚单位的第230位被取代为Glu，并且，还包含下述(aq)、(ar)或(as)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(aq)β亚单位的第118和200位，(ar)α亚单位的第6、36和126位，及β亚单位的第10、118和200位，(as)α亚单位的第36、148和204位，及β亚单位的第41、51和108位，所述(aq)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第118位被取代为Val，及β亚单位的第200位被取代为Glu，所述(ar)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第6位被取代为Thr，α亚单位的第36位被取代为Met，α亚单位的第126位被取代为Tyr，β亚单位的第10位被取代为Asp，β亚单位的第118位被取代为Val，及β亚单位的第200位被取代为Glu，所述(as)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第36位被取代为Met，α亚单位的第148位被取代为Asp，α亚单位的第204位被取代为Arg，β亚单位的第41位被取代为Ile，β亚单位的第51位被取代为Val，及β亚单位的第108位被取代为Asp，所述(16)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第13位被取代为Leu，α亚单位的第27位被取代为Ile，及β亚单位的第110位被取代为Asn，并且，还包含下述(at)、(au)或(av)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(at)α亚单位的第19、71和126位，(au)β亚单位的第46、108和212位，及(av)β亚单位的第150和217位，所述(at)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第19位被取代为Val，α亚单位的第71位被取代为His，及α亚单位的第126位被取代为Tyr，所述(au)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第46位被取代为Lys，β亚单位的第108位被取代为Arg，及β亚单位的第212位被取代为Tyr，所述(av)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第150位被取代为Ser，及β亚单位的第217位被取代为Cys，所述(17)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第13位被取代为Leu，β亚单位的第206位被取代为Leu，及β亚单位的第226位被取代为Ile，并且，还包含下述(aw)、(ax)或(ay)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(aw)α亚单位的第148和204位，(ax)β亚单位的第10、118和200位，及(ay)β亚单位的第40和61位，所述(aw)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第148位被取代为Asp，及α亚单位的第204位被取代为Arg，所述(ax)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第10位被取代为Asp，β亚单位的第118位被取代为Val，及β亚单位的第200位被取代为Glu，所述(ay)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第40位被取代为Ile，及β亚单位的第61位被取代为Val，所述(18)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第197位被取代为Cys，β亚单位的第107位被取代为Met，及β亚单位的第230位被取代为Glu，并且，还包含下述(az)、(ba)或(bb)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(az)β亚单位的第51和108位，(ba)β亚单位的第41和51位，及(bb)β亚单位的第48和146位，所述(az)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第51位被取代为Val，及β亚单位的第108位被取代为Asp，所述(ba)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第41位被取代为Ile，及β亚单位的第51位被取代为Val，所述(bb)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第48位被取代为Glu，及β亚单位的第146位被取代为Gly，所述(19)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第79位被取代为Asn，β亚单位的第230位被取代为Glu，及β亚单位的第231位被取代为Val，并且，还包含下述(bc)、(bd)或(be)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(bc)α亚单位的第6、19和126位，及β亚单位的第48、108和212位，(bd)α亚单位的第6、19和126位，及β亚单位的第46、108和212位，(be)α亚单位的第36位，及β亚单位的第176位，所述(bc)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第6位被取代为Thr，α亚单位的第19位被取代为Val，α亚单位的第126位被取代为Tyr，β亚单位的第48位被取代为Val，β亚单位的第108位被取代为Arg，及β亚单位的第212位被取代为Tyr，所述(bd)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第6位被取代为Thr，α亚单位的第19位被取代为Val，α亚单位的第126位被取代为Tyr，β亚单位的第46位被取代为Lys，β亚单位的第108位被取代为Arg，及β亚单位的第212位被取代为Tyr，所述(be)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第36位被取代为Trp，及β亚单位的第176位被取代为Cys，所述(20)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第197位被取代为Cys，β亚单位的第24位被取代为Ile，及β亚单位的第107位被取代为Met，并且，还包含下述(bf)或(bg)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(bf)β亚单位的第41、51、108和230位，(bg)α亚单位的第48位，及β亚单位的第146和230位，所述(bf)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第41位被取代为Ile，β亚单位的第51位被取代为Val，β亚单位的第108位被取代为Asp，及β亚单位的第230位被取代为Glu，所述(bg)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第48位被取代为Glu，β亚单位的第146位被取代为Gly，及β亚单位的第230位被取代为Glu，所述(21)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，β亚单位的第24位被取代为Ile，及β亚单位的第79位被取代为Asn，并且，还包含下述(bh)所示的突变位点的氨基酸被取代为其它氨基酸的取代，(bh)α亚单位的第6、19和126位，及β亚单位的第48、108、212、230和231位，所述(bh)所示的突变位点被取代为其它氨基酸时，α亚单位的第6位被取代为Thr，α亚单位的第19位被取代为Val，α亚单位的第126位被取代为Tyr，β亚单位的第48位被取代为Val，β亚单位的第108位被取代为Arg，β亚单位的第212位被取代为Tyr，β亚单位的第230位被取代为Glu，及β亚单位的第231位被取代为Val。