一种鸡脑乙酰胆碱酯酶的双水相萃取方法及其对氨基甲酸酯类农药的敏感性检测方法

摘要

本发明公开了一种鸡脑乙酰胆碱酯酶的双水相萃取方法及其对氨基甲酸酯类农药的敏感性检测方法。以鸡肉加工中的废弃器官-鸡脑为酶的材料来源，其工艺步骤包括：粗酶液的制备、双水相萃取、反萃取、透析及真空冷冻干燥，即可得到鸡脑乙酰胆碱酯酶制品。本发明所得酶制品，高值化利用了废弃器官鸡脑，成本低、耗时短，且酶活较高，比活力可达到4.56U/mg。通过对两种酶的半抑制浓度和双分子速率常数的研究发现鸡脑乙酰胆碱酯酶对氨基甲酸酯类农药具有更高的敏感性。本发明不仅解决了传统乙酰胆碱酯酶成本高、产量低、价格昂贵的问题，而且得到了对氨基甲酸酯类农药高度敏感的酶制品，对氨基甲酸酯类农残的检测具有重要意义。

主权项

一种鸡脑乙酰胆碱酯酶的双水相萃取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1）将新鲜的用生理盐水冲洗干净的鸡脑组织与含TritonX‑100的磷酸盐缓冲液按质量/体积比1：2～1：6混合，均质后静置5~15min，离心机6000～10000r/min，0～4℃离心10～30min，取上清液，用水稀释2～8倍后即得乙酰胆碱酯酶粗酶液；所述磷酸盐缓冲液中TritonX‑100的质量分数为0～1.0 %；2）PEG‑1000/(NH₄)₂SO₄双水相体系：体系总质量为5～15g，其中PEG‑1000的质量占体系总质量的10～20%，(NH₄)₂SO₄的质量占体系总质量的10～20%，体系pH为5～7，乙酰胆碱酯酶粗酶液加入量为体系总质量的10～20%，其余成分为水，以此建立双水相体系，搅拌5～15min后，静置分相，以蒸馏水代替上清液加入体系中作为空白组，收集乙酰胆碱酯酶所富集的上相作为实验组及收集相应的空白组上相；3）PEG‑1000/K₂HPO₄反萃取体系：体系总质量为8～10g，将收集的实验组及空白组上相调节pH为3～7，按照2:1～6:1的体积比例加入质量体积比为30～50%K₂HPO₄盐溶液，搅拌均匀后，静置分相，形成新的双水相体系，记录上下相体积，收集下相；4）将收集的下相用磷酸盐缓冲液进行透析，将透析袋内的溶液进行真空冷冻干燥，即得鸡脑乙酰胆碱酯酶的酶粉，配制成酶液后测定比活力。