完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法

摘要

本发明公开了一种完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法。该方法是在正常生长的细胞培养液中加入翻译延伸抑制剂，待翻译延伸抑制剂有效作用于RNC，抑制翻译延伸的进行后，将细胞冷却至0～4℃，再用预冷至0～4℃的PBS溶液清洗细胞以及加入细胞中，液氮中快速冷冻，超低温保存，于冰上解冻，再抽提RNC。本发明通过采用翻译延伸抑制剂有效固定核糖体，使之不易解离，将细胞内的翻译状况固定下来；再通过液氮急冻方法有效地冷冻保存RNC长期储存和运输，并且解冻后所提取的RNC与新鲜细胞提取的RNC无异，因此本发明突破了时间和空间的限制，为研究RNC及开展RNC商业服务提供了便利。

主权项

一种完整冷冻保存及解冻细胞内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于包括如下步骤：首先通过翻译延伸抑制剂抑制细胞的翻译活动，然后去除培养液，清洗细胞，再将清洗后的细胞用液氮进行快速冷冻处理，接着将快速冷冻处理好的细胞置于不高于‑80℃的环境下保存；使用时将细胞转移至冰上解冻即可；具体步骤如下：(1)抑制细胞的翻译活动：在正常生长的细胞培养液中加入翻译延伸抑制剂，摇匀，翻译延伸抑制剂的用量为能稳定抑制细胞翻译延伸；接着将细胞置于原培养环境中培养，该培养的目的是为了使得翻译延伸抑制剂能有效作用于RNC，抑制翻译延伸的进行；然后将细胞立即冷却至0～4℃，以使其其余代谢过程基本停止，防止RNC被降解；(2)去除培养液，对不同细胞的操作具体如下：①对悬浮培养细胞进行离心，弃上清，取沉淀；②对贴壁生长细胞而言，倒出培养液即可；(3)清洗：使用预冷至0～4℃的PBS溶液清洗细胞，清洗完毕后弃去PBS溶液；对不同细胞的操作具体如下：①将PBS溶液加入悬浮培养细胞中，将悬浮培养细胞悬于PBS溶液后离心，弃上清，取沉淀；②将PBS溶液加入贴壁生长细胞中，再倒出PBS溶液即可；(4)快速冷冻处理：加入预冷至0～4℃的PBS溶液，待速冻完毕温度稳定在液氮温度后进行下一步；对不同细胞的操作具体如下：①对悬浮培养细胞的操作为将细胞悬于PBS溶液后立即浸没于液氮中；②对贴壁生长细胞的操作为将PBS溶液浸没过细胞后立即放入液氮中；(5)超低温保存：将速冻完毕的细胞转移至超低温保存环境，该超低温保存环境应满足温度始终不高于‑80℃；在该条件下，能进行储存和运输；(6)解冻：储存和运输后需解冻以继续提取RNC时，将细胞从超低温保存环境迅速转移至冰上，等待解冻过程中避免震动，直至完全解冻；所述的翻译延伸抑制剂为放线菌酮或氯霉素。