人成纤维细胞生长因子21原核细胞中可溶性表达及制备

摘要

本发明提供了一种重组制备人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblast Growth Factor 21，FGF-21)的方法，包含编码人FGF-21的重组表达载体和宿主细胞，表达方式和制备方法。实现在大肠杆菌中直接表达具有高生物活性、无需复性的重组人FGF-21的工艺。

主权项

一种重组制备人成纤维细胞生长因子‑21的方法，通过构建含编码人成纤维细胞生长因子‑21蛋白cDNA的原核表达载体pET‑3c和大肠杆菌BL21(DE3)PlysS，可溶性表达和纯化人成纤维细胞生长因子‑21蛋白，所述cDNA的核苷酸序列如下：atgcacccaa tcccagattc tagtccactg ttacaattcg gaggtcaggt tcgtcaacgttatctgtata ccgatgacgc acagcagacc gaagcccatt tggaaattcg tgaagatggaaccgttggtg gtgctgccga tcaatctcct gaatcactgt tacagctgaa agcattgaaaccaggagtta ttcagattct gggtgtcaaa acctctcgtt ttttatgtca acgtcctgacggtgccctgt atggaagttt gcattttgat ccagaagcct gttcttttcg tgaactgttactggaagatg gttataatgt ttatcagtca gaagcccacg gtttgcctct gcatttaccaggaaataaat ctcctcatcg tgacccagca cctcgtggtc cagcccgttt tctgccattgccaggtctgc ctccagctct gcctgaacca cctggtattc tggccccaca gcctccagatgttggtagtt ctgatcctct gtcaatggtc ggtccatctc aaggtcgtag tccttcttatgcatca；而且，该方法包含以下步骤：1)将构建的大肠杆菌pET‑FGF21/BL21(DE3)PlysS划线接种于LA琼脂平板，所述LA是LB培养基中加入100μg/ml Amp，37℃培养过夜；从过夜培养的LA平板上挑取菌苔接种于含LB液体培养基试管中，37℃活化12小时，然后按1％的比例转接到含200ml LB培养液的1000ml三角瓶中，37℃培养过夜即成为上罐种子液；将上罐种子液按5％的比例接种于含20LM9+YT培养液的30L发酵罐中，37℃培养，整个发酵过程中，通过调节转速、通空气量、通纯氧量来保持溶氧＞30％，用28％的氨水调节pH并保持在7.0；培养菌液OD₆₀₀＝4.0～6.0时，将培养温度降至23℃，至菌液OD₆₀₀＝8.0～10.0时，加入终浓度为0.5mM IPTG，继续培养12小时后停止发酵，发酵液用冷冻高速离心机在4℃下8000rpm离心10min，收集菌体，置‑20℃冻存24小时；每1g菌体加入10ml破菌缓冲液，所述破菌缓冲液配方是50mM Tris，5mM EDTA，pH10.3，30℃水浴搅拌1小时后，用ATS公司的型号为AH‑BASIC的压力匀浆机500Pa匀浆两次，用显微镜观察，菌体完全破碎，呈絮状；然后4℃下10000rpm离心10min，收集上清；2)硫酸铵沉淀：向上清中补入40％的饱和硫酸铵溶液，4℃放置30min后，4℃下8000rpm离心10min，收集沉淀；3)沉淀溶解：每1g沉淀用20ml的10mMPB，pH8.0缓冲液溶解，室温搅拌4～5小时；4)Phenyl Sepharose F.F.层析：缓冲液：溶液A：10mM PB，15％饱和硫酸铵溶液，pH8.0；溶液B：10mMPB，pH8.0；平衡：用4CV的溶液A冲洗层析柱；上样：硫酸铵沉淀后重新溶解上样；复平衡：再用4CV的溶液A冲洗层析柱；洗脱：用溶液B冲洗柱子；收集：收集溶液B的洗脱峰，为人成纤维细胞生长因子‑21的粗纯化样峰；5)透析：按照体积比1∶200的pH8.0的10mM PB缓冲液对Phenyl Sepharose F.F.层析柱洗脱样品透析12小时；6)Q Sepharose F.F.层析：缓冲液：溶液A：10mM PB，pH8.0；溶液B：10mM PB，0.05M NaCl，pH8.0；溶液C：10mM PB，0.25M NaCl，pH8.0；平衡：用4CV的溶液A冲洗层析柱；上样：透析12小时后的人成纤维细胞生长因子‑21样品上样；复平衡：再用溶液A冲洗层析柱至吸收值达基线；洗脱1：用溶液B冲洗柱子，除去杂蛋白；洗脱2：用溶液C冲洗柱子；收集：收集溶液C的洗脱峰，为人成纤维细胞生长因子‑21的纯化样峰；7)反相层析：层析介质：Welch XB‑C18缓冲液：溶液A：5％乙腈，0.1％三氟乙酸，pH2.7；溶液B：95％乙腈，0.1％三氟乙酸，pH2.7；平衡：用4CV的溶液A冲洗层析柱；上样：Q Sepharose F.F.层析柱洗脱样品上样；复平衡：用溶液A冲洗层析柱至吸收值为基线；洗脱：用从0％～100％B液线性洗脱层析柱10CV；收集：收集人成纤维细胞生长因子‑21样品峰。