白细胞介素-10的制备工艺及应用

摘要

本发明公开了医药生物技术领域的一种白细胞介素-10的制备工艺及应用，制备工艺包括：PCR扩增hIL-10基因、构建hIL-10表达载体、转化DH5α感受态细胞、重组质粒鉴定、电转化毕赤酵母X-33菌株重组酵母菌的筛选、rhIL-10蛋白表达及鉴定试剂配制、rhIL-10的诱导表达、rhIL-10的检测、分离、Westernblot鉴定、分装保存，制备的rhIL-10，在自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤及移植免疫等多种疾病中发挥重要作用。本发明主要关键技术包括hIL-10在毕赤酵母X-33中诱导表达的培养基改良配方、培养条件、起始酵母菌浓度、目的蛋白收集时间、rhIL-10的纯化技术，rhIL-10在抗皮肤抑制排斥反应的家兔皮肤移植模型及动物试验中的用药,rhIL-10在抗佐剂性关节炎大鼠模型的实验治疗应用等。

主权项

白细胞介素‑10的制备工艺，其特征在于，包括由以下步骤制备：步骤1，PCR扩增hIL‑10基因：根据hIL‑10基因全长和质粒pPICZαA中的多克隆位点，用软件PimerPremier设计引物；上游引物：5’CGGAATTCATGGCCCACAGCTCAGCA3’，下游引物：5’GCTCTAGACAGTTTCGTATCTTCATTGTC3’；其中斜体划线部分为引入的EcoRI位点XbaI位点，以质粒pORF‑hIL‑10为模板经PCR扩增hIL‑10，PCR反应条件为：50μl反应体系中，94℃，预变性10min，94℃变性45s，52℃，退火45s，72℃，延伸1min，35个循环，72℃延伸10min；步骤2，构建hIL‑10表达载体：使用EcoRI/XbaI对纯化后的hIL‑10基因及质粒pPICZaA进行双酶切，用凝胶回收试剂盒分别回收目的片段，取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，并以T4连接酶连接两种目的片段得到连接产物；步骤3，转化DH5α感受态细胞：将连接产物转化感受态E.coliDH5α，并涂布于含25μg/μlZeocin的LB平板，重组菌落形成后，以单个菌落接种液体LB后抽提重组质粒；步骤4，重组质粒鉴定：以EcoRI/XbaI对所提重组质粒做双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳并经凝胶成像系统拍照，同时送另一份质粒作DNA测序，经鉴定构建正确的质粒命名为pPICZαA‑hIL‑10；步骤5，电转化毕赤酵母X‑33菌株重组酵母菌的筛选：以重组质粒pPICZαA‑hIL‑10电转化感受态毕赤酵母X‑33，所得产物涂布于含Zeocin浓度为50~1000μg/ml的YPDS平板，平板上形成的菌落即为重组酵母菌，YPDS平板筛选到的重组酵母菌保存备用；步骤6，rhIL‑10蛋白表达及鉴定试剂配制：a、rhIL‑10蛋白表达试剂的准备；b、rhIL‑10蛋白鉴定试剂的准备；步骤7，rhIL‑10的诱导表达：a、挑取经步骤5筛选到的重组酵母菌，接种于2mlYPD液体培养基中，30℃，250～300r/min振荡培养24h；b、按1：100m1比例，取24h培养物接种于BMGY培养基中，30℃，发酵培养至OD600达到5.0；c、取发酵培养菌液按5000r/min常温离心5min，弃上清，收集菌体；d、按1：4比例，加入无菌水洗涤1次，5000r/min离心5min，弃上清，收集沉淀菌体；e、菌体以BMMY培养基重悬，转入PH值5.5~7.5、发酵温度26~28℃发酵培养，以终浓度为0.5%的甲醇诱导表达；f、每12h取1ml诱导培养液，离心后分离上清和菌体，于负20℃冷冻保存，同时向剩余的诱导培养液中补加培养液和甲醇；g、4天后停止诱导，5000r/min离心5min，收集上清和菌体；步骤8，rhIL‑10的检测：a、染色检测：取不同时间段培养液作SDS‑PAGE和考马斯亮蓝R250染色；并经凝胶成像系统拍照；b、ELASA法检测：根据IL‑10标准品作标准曲线，以ELISA法测定36h时段培养液中的rhIL‑10浓度；c、Bradford法检测：以Bradford法检测同时段培养液总蛋白浓度，发酵上清液经Bradford法检测；步骤9，分离、Westernblot鉴定：以步骤8中36h时段的发酵上清液作SDS‑PAGE后进行Westernblot分析；步骤10，分装保存。