基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法

摘要

本发明公开了一种基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法，构建荧光供体克隆pBluescript-pLac::luxAB-MCS；受体蛋白选择绿色荧光蛋白GFP等；在MCS处选择合适酶切位点分别将三种荧光蛋白克隆到MCS处；产生BRET信号的模式体；检测三个BRET模式体的荧光素酶的荧光强度；选择三个荧光强度值都较强的模式体作为BRET信号产生的荧光供体；通过生物荧光显微镜(Leica)检测荧光蛋白的表达情况，选择合适的荧光受体；通过荧光分光光度计检测BRET模式体的信号。本发明通过细菌荧光素酶luxAB作为检测两蛋白互作的荧光供体与eYFP作为荧光受体产生BRET信号，构建BRET模型，该系统可以在体内检测两个蛋白的动态互作，提高了检测蛋白质相互作用的准确性，作为检测原核细胞内蛋白质互作的较理想系统。

主权项

一种基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法，其特征在于，该基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法包括以下步骤：步骤一，构建克隆pBluescript‑pLac::luxAB‑MCS；步骤二，受体蛋白选择绿色荧光蛋白GFP、增强型黄色荧光蛋白eYFP、橙色荧光蛋白morange；步骤三，在MCS处选择酶切位点分别将三种荧光蛋白克隆到MCS处；步骤四，去掉luxB的终止密码子TAA，形成细菌荧光素酶和荧光蛋白的融合体；步骤五，分别得到pBluescript‑pLac::luxAB‑GFP、pBluescript‑pLac::luxAB‑eYFP、pBluescript‑pLac::luxAB‑mOrange三个重组载体，产生BRET信号的模式体；步骤六，通过酶标仪检测三个BRET信号模式体荧光素酶的荧光强度；步骤七，检测三个模式体荧光强度值数量级为1×10⁸,荧光强度值都较强,能够作为BRET信号产生的荧光供体；步骤八，通过生物荧光显微镜Leica检测荧光蛋白，选择合适的荧光受体；在步骤一中，构建克隆pBluescript‑pLac::luxAB‑MCS的具体步骤为：首先以pDM4‑luxBox含有luxCDABE基因序列为模板扩增目的基因，PCR的反应体系为50μL：去离子水33.5μL，10×PCR buffer5μL，dNTPs 5μL，MgSO₄ 2μL，正反向引物各1.5μL，模板DNA 0.5μL，Taq DNA聚合酶1μL，PCR产物用含0.5μg/mL溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶进行电泳分离，在紫外灯下切下目的条带，用DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收；PCR反应程序为：94℃，反应3min；(94℃,30s；50℃,30s；72℃,2.5min)30×cycles；72℃,10min；电泳分离上述PCR产物的条件为：1×TAE缓冲液，电压5V/cm，电泳40min，切胶回收PCR目的条带；PCR扩增产物50μL双酶切反应体系包括：PCR产物20μL，10X buffer 5μL，限制性内切酶各1μL，ddH2O补足体积至50μL；同理也是载体50μL酶切体系：8μL载体质粒，10X buffer 5μL，限制性内切酶各1μL，最后用去离子水补足体积至50μL，酶切后回收；连接反应：连接体系包括目的片段6.5μL，酶切后的载体2.5μL，T4buffer 1μL，T4DNA连接酶0.3μL，充分混匀后16℃过夜连接；在步骤七中，BRET信号产生的供体选择明亮发光杆菌的细菌荧光素酶、基因luxAB基因表达的细菌荧光素酶由pDM4‑lux Box表达；该基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法将荧光素酶基因luxAB和eYFP分别克隆到pKT100和pBluescript载体上，并使用Lac启动子来起始基因的转录，得到重组载体pBluescript‑pLac::eYFP·FlgM、pBluescript‑pLac::FlgM·eYFP和pKT100‑pLac::luxAB·FliA，分别共转化到大肠杆菌宿主细胞中，然后通过检测BRET信号是否产生，即是否能检测到eYFP的发射光荧光信号就能确定选取的两个蛋白是否有相互作用。