人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导的方法

摘要

本发明涉及细胞冻存复苏诱导技术领域，特别涉及一种人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导的方法：PBMC的分离与冻存：冻存母液组成为DMSO和低分子量40KD右旋糖苷,甘油磷脂，EG；PBMC的复苏；复苏后向AIL诱导：诱导因子为IFN-γ、ATP、IL-1α、IL-2、IL-7、CD3单抗、CD28。本发明中复苏的细胞存活率94.2%±3.42%，利用冻存技术保存了PBMC的细胞活性，复苏后诱导为AIL细胞的比率为53.1%，活化率高，从而提高了采集的外周血单个核细胞的复苏和诱导活化率。

主权项

一种人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后诱导的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）PBMC的分离与冻存：用淋巴细胞分离液分离人体外周血单个核细胞，离心弃上清，细胞沉淀用冷冻保存液悬浮，冷冻保护液为500ul细胞培养液，再加等体积的冻存母液，放在样本冻存盒，转移至程序降温盒仪，最终将细胞保存于‑196 ℃液氮内，冻存母液体积百分比组成为20%‑40%DMSO和低分子量40KD右旋糖苷70%‑40%,5%‑10%甘油磷脂，5%‑10%EG；（2）PBMC的复苏：将装有待复苏人体外周血单个核细胞的冻存管放入37℃水中，并不断摇动，保证管内液体在1min 内80%溶解，然后将复苏的人体外周血单个核细胞加入装有DMEM培养基的离心管中离心，去上清，得到复苏的PBMC；（3）复苏后向AIL诱导： PBMC按照细胞密度(0.4‑1.2)×10⁶/mL用X‑VIVO15重悬，添加300‑2000u/mL IFN‑γ和50‑100u/mL ATP诱导培养AIL细胞，第二天补加因子50‑200u/mL IL‑1α、500‑2000u/mL IL‑2、500‑1000 u/mL IL‑7、50‑200ng/mL CD3单抗、50‑200ng/mL CD28；此后每天观察细胞生长状态，每隔1‑2天添加含有500‑2000u/mL IL‑2的X‑VIVO15 培养基。