猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法

摘要

本发明公开了一种猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，包括以下步骤：生产用细胞的传代与培养，形成单层细胞；生产用种毒的繁殖，将基础种毒接种于单层细胞培养；单层细胞消化成细胞悬浮液接种于生物反应器中培养；制苗毒液的繁殖，细胞计数结果达到5×10⁶个单位/ml～5×10⁷个单位/ml后，将生产用种毒接种于细胞培养；病毒液的收获。本发明可以大量降低生产成本，而且生产周期短，每个生产周期仅需5-7天，并且相比现有转瓶培养法所生产的猪传染性胃肠炎病毒效价更高；具有自动化程度高，用人少，生产工艺简单稳定，同时易操作、产量大占用场地小，易于快速扩大生产规模，并且质量易于实现均衡稳定；环境污染少且易于处理。

主权项

一种猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：生产用细胞的传代与培养：取生长良好的PK15或ST细胞，经EDTA‑胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，培养温度为37℃，形成良好单层PK15或ST细胞；步骤二：生产用种毒的繁殖：在PK15细胞或ST细胞形成单层后，倒掉细胞生长液，将猪传染性胃肠炎病毒接种到步骤一的单层细胞上，猪传染性胃肠炎病毒的接种量与步骤一中细胞生长液的体积比为1:10，将细胞瓶迅速翻转使传染性胃肠炎病毒充分浸没单层细胞，置于37℃、体积百分含量为5％的二氧化碳培养箱中吸附1h，然后加入含有10μg/ml胰酶的细胞维持液，置于37℃、体积百分含量为5％的二氧化碳培养箱培养，逐日观察，当75％～80％细胞出现病变时，收获病毒置于‑15℃冰箱中，反复冻融细胞三次，此病毒液作为生产用种毒；步骤三：PK15或ST细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：向无菌检验合格的、含有微载体的容积为75L的生物反应器中加入总培养体积的2/3体积的细胞生长液，取步骤一中已形成良好单层PK15或ST细胞，经EDTA‑胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按5×10⁵个细胞/ml～5×10⁶个细胞/ml的密度接种于生物反应器中进行培养；步骤四：制苗毒液的繁殖：观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果达到5×10⁶个细胞/ml～5×10⁷个细胞/ml后进行接毒操作，所接入种毒为步骤二中的生产用种毒，接毒前用含有10μg/ml胰酶的病毒培养液洗涤生产用种毒2‑4次，生产用种毒接种量为0.01‑0.5MOI；步骤五：病毒液的收获：待微载体上细胞全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置于‑20℃反复冻融两次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得病毒液；所述EDTA‑胰酶细胞分散液为含有质量体积分数为0.25％的规格1：250的胰酶和0.02％的EDTA的Hank's液，所述的规格1：250的胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶；所述细胞生长液的配方为：重量分数为90％‑98％DMEM液、2％‑10％牛血清，终浓度为200‑1000单位/ml的抗菌素，pH为6.8‑7.6；所述步骤四中的病毒培养液的配方为：重量分数分别是90％‑95％DMEM液，5％‑10％牛血清，终浓度为200‑1000单位/ml的抗菌素，pH为6.8‑7.6。