| 主权项 |
一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①磁分离试剂的制备：选用 100mg 具有顺磁性、表面带有羧基活性基团的磁分离微粒用 0.1mol/L、pH 4.5 的 2‑ （N‑吗啉代）乙磺酸 MES 溶液 10mL 洗涤 3 次后，磁分离微粒用该溶液 1mL 重悬；之后加入50‑250μ l 浓度为 10mg/ml 碳二亚胺 EDC 活化，25℃混匀 2 小时，加入 2mg 抗 FITC 抗体，37°C 混合均匀 2 小时；之后加入 1mL 浓度为 0.01mol/L PBS 缓冲液于 37°C 密闭静置 1 小时，所述 PBS 缓冲液为 pH7.4 的含有 5%牛血清白蛋白 BSA 的 PBS 缓冲液；最后用 10mL 含有 0.5% BSA 的 0.01mol/L PBS 缓冲液洗涤磁分离微粒 3 次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液；②抗试剂的制备：将 DON 单克隆抗体溶液与 FITC 共价连接；③酶标抗原试剂的制备：所述酶标抗原试剂的制备包括以下成分的制备：DON‑BSA 偶联物以及酶标抗原试剂；（1）DON‑BSA 偶联物的制备：取 20mgDON、1mol 马来酸酐以及 0.05‑0.1mol 的 4‑二甲氨基吡啶 DMAP，溶于 2ml 甲苯，80°C 搅拌 12 小时，蒸干溶剂，酸化，萃取，重结晶后得到 DON 半抗原；将 60mg 牛血清白蛋白溶于 9.5mL 0.01mol/L、 pH 5.0 的 PBS 溶液中，加入 12.5mgEDC，再加入 1ml 溶解了 10mgDON 半抗原的二甲基甲酰胺 DMF 溶液，25°C 搅拌反应 2 小时，再加入 6mgEDC，置于阴暗处搅拌反应 12 小时，用 0.01mol/ L PBS 透析 72 小时，每8 小时更换 1 次透析液，即得到 DON‑BSA 偶联物；⑵酶标抗原试剂制备：a.将 5mg DON‑BSA 偶联物溶于 0.01mol/L pH7.4 的 PBS 溶液中，加入 0.1mol/mL 活化剂2‑Iminothiolane·HCl 溶液 20μ L，20℃放置 30 分钟后加入甘氨酸终止反应；20℃静置 3‑5分钟；过柱子除去活化剂，收集蛋白峰；b.将碱性磷酸酶 ALP 溶于 pH8.0 的 2mmol/L EDTA、20 mmol/L Tris‑HCl 溶液中，浓度5mg/mL，加入 0.10mg/mL 巯基活化试剂，室温放置 40 分钟，过柱子除去活化剂，收集蛋白峰；将 步骤a 和 步骤b 获得的蛋白按照抗原与碱性磷酸酶分子摩尔比 1:1 混合，室温放置 3 小时，然后用凝胶层析柱分离纯化，收集第一峰和第二峰，除去未连接的游离抗原和碱性磷酸酶，将产物保存在 4℃，将上述产物用酶反应物稀释液稀释到 5μ g/mL，使用 0.2μ m 过滤器过滤后 4℃保存；其中，酶反应物稀释液配置方法：Tris 12.5g，氯化钠 8.5g，叠氮钠 1g，加纯化水至 600mL，调整 pH 值至 7.5；加吐温‑20 1mL，BSA 10g，加纯化水定容至 1L；用 0.2μ m 过滤器过滤，于 4℃保存；④清洗液的制备：取 Tris12.54g、NaCl 325.6g 与吐温‑20 5g 先溶于 900ml 水中，再取 0.2ml 液体生物防腐剂Proclin‑300 溶于溶液中，最后将 pH 调整至 7.4 并定容至 1000ml，完全溶解后用 0.2μ m滤器过滤即得清洗液浓缩液，使用时稀释 20 倍即得清洗液；⑤校准品与质控品的制备：将 DON 抗原称重后用标准品缓冲液溶解分装，校准品浓度分别为 1 ng/mL 、10ng/mL 、40 ng/mL 、200 ng/mL 与 1000 ng/mL ，质控品溶度为 1 ng/mL 与 100 ng/mL ，4°C 保存；其中，标准品缓冲液的配制：取 Tris 2.42g、NaCl 2g，BSA2.5g, Proclin‑300 1ml 溶解于 1000ml纯化水，pH 调整至 7.4，用 0.2 μ m 过滤器过滤，4°C 保存；⑥底物溶液的制备：取乙醇胺 100g， NaCl 2g，单磷酸酚酞 4g，用纯化水配成 1000ml，用 37％盐酸调 pH 至8.4，用0.2μm 过滤器过滤，于 4℃保存；⑦终止液的制备取 NaCl 1‑2g, Na<sub>2</sub> CO<sub>3</sub> 10‑15g,EDTA 10‑15g，用纯化水配制成 1000ml,用 0.2μm 过滤器过滤，常温保存。 |
