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一种基于杂交链式反应信号放大技术测定赤霉素的方法，其特征是将赤霉素抗体固定在羧基化磁珠上，在目标物赤霉素存在时，磁珠上赤霉素抗体、胶体金上的赤霉素抗体与赤霉素之间形成夹心式免疫复合体，加入富含G碱基的H1和H2，在胶体金上的DNA1激发杂交链式反应，从而在免疫复合物上形成富含G碱基的DNA长链，在化学发光试剂3,4,5‑三甲氧基苯甲酰甲醛的作用下产生化学发光，根据化学发光实现赤霉素的测定，测定步骤为：(1)抗体标记磁珠的制备将0.2mL 10mg/mL的羧基化磁珠加入到一小离心管中，用0.4mL 0.1M咪唑–HCl缓冲溶液洗三遍；然后用咪唑–HCl缓冲溶液分散成0.4mL的溶液，再将0.4mL 0.25M N‑羟基琥珀酰亚胺和0.5M 1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐加入该小离心管中，在37℃下培养30分钟；然后用0.4mL 0.1M pH＝7.4的磷酸盐缓冲液清洗三遍，再用0.4mL0.1M的磷酸盐缓冲液分散成溶液，将得到的抗体标记磁珠存放在4℃的环境中备用；(2)抗体和DNA1标记胶体金的制备首先将5μL 10mM的三(2‑羰基乙基)磷盐酸盐加入100μL 10<sup>‑6</sup>M DNA1溶液中，37℃下培养30分钟，得三(2‑羰基乙基)磷盐酸盐活化过的100μL 10<sup>‑6</sup>M DNA1溶液；再将200μL2mg/mL的GA抗体加入到粒径为20nm的1.0mL胶体金溶液中,在室温下培养30分钟，再加入用TCEP活化过的100μL 10<sup>‑6</sup>M DNA1溶液，在室温下轻摇16小时后，得抗体和DNA1标记胶体金溶液；再用2.0mL 0.1M pH＝7.4的磷酸缓冲液洗涤三次，并用2.0mL磷酸盐缓冲液进行悬浮处理，并在4℃环境下保存；(3)水果和蔬菜样品制备过程将样本切碎、混合，研磨得到均匀的混合物，然后，取10g均匀的混合物放在100mL的锥形瓶中，在锥形瓶中加入25mL乙醇溶液后，将样品进行超声波处理10分钟，再将经超声波处理后的样品用孔径为0.45μm的微孔膜过滤；(4)分析测定首先将微孔膜过滤后的样品或标准溶液与抗体标记磁珠混合，反应5‑30分钟，再进行磁分离后，用50μL PBST缓冲液洗涤两遍，并将其悬浮在50μL的磷酸盐缓冲溶液中；然后，加入5‑20μL抗体和DNA1标记胶体金，在室温下反应30分钟后进行磁分离，并且使用50μL PBST缓冲液洗涤三次；然后加入20μL含0.5μM的H1和H2的混合溶液进行杂交链式反应，在室温下反应10‑70分钟后，再用50μL PBST溶液洗涤三遍，然后使其悬浮于40μL磷酸缓冲溶液中，将得到的溶液进行化学发光检测；(5)化学发光检测使用IFFS‑E型多功能化学发光检测仪进行化学发光检测，将一个2mL的小玻璃瓶放在化学发光检测仪的光电倍增管暗箱中，然后向小玻璃瓶中加入10μL pH为8.5的四丁基氢氧化铵‑磷酸盐缓冲液，接着再加入步骤(4)所得的溶液10μL；再用注射器从光电倍增管顶端小孔中注入100μL 30mM的3,4,5‑三甲氧基苯甲酰甲醛溶液，引发化学发光反应，根据化学发光强度对样品或标准溶液的浓度进行定量测定；所述的DNA1、H1和H2的核苷酸序列如下：DNA1,5’‑SH‑CCCCAACTCCTCCCAAAAAAAAAAACAAAGTAGTCGAGGCCC‑3’；H1,5’‑AGTCGAGGCCCCGGCGTGGGTTAACACGCCGGGGCCTCGACTACTTTG‑3’；H2,5’‑TTAACCCACGCCGGGGCCTCGACTCAAAGTAGTCGAGGCCCCGGCGTG‑3’；分析测定时使用10μL抗体修饰磁珠，抗体和DNA1修饰胶体金用量为20μL，样品或标准溶液与抗体标记磁珠混合反应时间为30分钟，杂交链反应时间为70分钟。 |
