一种新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法

摘要

本发明公开了一种新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法，该方法对获得新疆雪莲愈伤组织经继代、低大气压力预培养、超低温保存、解冻和再培养，明显提高超低温保存后愈伤组织的复活率。为新疆雪莲的种质保存提供技术依据，可用于新疆雪莲的种质保存。

主权项

一种以子叶节为外植体的新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法，其特征在于，按以下步骤进行：步骤一，新疆雪莲愈伤组织的获得：取新疆雪莲种子，用浓度为0.1％的升汞进行表面灭菌，再转接到MS培养基上进行萌发；将萌发后长出的子叶作为外植体，切割成0.3cm²大小，然后接到组成为2.5mg/L a‑萘乙酸和0.5mg/L 6‑苄氨基腺嘌呤的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为3000Lux，光周期16小时；培养35天后获得新疆雪莲愈伤组织；步骤二，新疆雪莲愈伤组织的继代：将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到组成为a‑萘乙酸2.5mg/L、6‑苄氨基腺嘌呤0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux，光周期16小时；培养25天后可用于低大气压力预培养；步骤三，新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养：将培养25天的新疆雪莲愈伤组织，转移到40kP～60kP低大气压力下的培养容器中，预培养4‑8天，然后直接作为超低温保存的材料；步骤四，新疆雪莲愈伤组织的超低温保存：将经过低大气压力预培养的新疆雪莲愈伤组织在室温下无菌转移到60％的玻璃化溶液中处理30分钟，再在0℃下无菌转移到浓度为100％的玻璃化溶液中处理45分钟，再用100％的玻璃化溶液洗涤，然后装入冷冻管并投入液氮中保存；步骤五，超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养：从液氮中取出装有新疆雪莲愈伤组织的冻存管立即投入37℃温水中解冻3分钟，然后将解冻的愈伤组织在室温下用MS液体培养基洗涤3次，洗涤时间为每次3分钟，将洗涤后的愈伤组织转接到组成为a‑萘乙酸2.5mg/L、6‑苄氨基腺嘌呤0.5mg/L的MS培养基上培养，开始5天为暗培养，然后转移到光照下培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux，光周期16小时，总共培养40天后，在冻存愈伤组织的表面形成新的愈伤组织。