一种农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种农杆菌介导的甘监型油菜遗传转化方法，包括以下步骤：取甘蓝型油菜幼苗的下胚轴，以下胚轴的下端为外植体进行预培养，诱导产生愈伤组织；利用携带目的基因的农杆菌侵染愈伤化的外植体，然后进行共培养；共培养后的外植体在含选择剂的分化培养基上诱导生成抗性不定芽；进行生根培养，获得抗性苗。本发明因以甘蓝型油菜下胚轴的下端为外植体，且使用了最适于甘蓝型油菜遗传转化的生长条件，特别是共培养基中的pH值和两种高低浓度草甘膦分化筛选方式，成功获得了抗草甘膦的转基因植株，并与现有技术相比具有更高的抗性苗分化率，建立了一个高效的抗草甘膦的甘蓝型油菜再生体系，为研究甘蓝型油菜农杆菌介导的转基因技术奠定基础。

主权项

一种农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取甘蓝型油菜幼苗的下胚轴，以下胚轴的下端为外植体进行预培养，诱导产生愈伤组织；所述甘蓝型油菜的品种为浙大619；所述甘蓝型油菜幼苗的培养方法包括：将油菜种子消毒后平铺在固体培养基上进行培养直至获得幼苗，所述固体培养基为：1/2MS+18.0g/L蔗糖+9.0g/L琼脂，pH为5.8；所述下胚轴的下端为下胚轴靠近胚根的长0.5～1cm的部分；所述预培养的培养基为：MS+2.5mg/L 2.4‑D+18.0g/L蔗糖，pH为5.8；(2)利用携带抗草甘膦基因的农杆菌侵染愈伤化的外植体，然后进行共培养；所述农杆菌侵染愈伤化的外植体包括：制备侵染液，将愈伤化的外植体浸入侵染液中3～10分钟，取出后吹干；所述侵染液制备方法包括：(A)农杆菌的活化；(B)将活化后的农杆菌接入液体培养基，当培养液OD₆₀₀值达到0.8～1时，分离获得农杆菌；所述液体培养基为：YEB+12mg/L四环素+50mg/L卡那霉素；(C)将分离得到的农杆菌混入1/5MS+15g/L蔗糖的培养液中，悬浮制得侵染液；所述共培养的培养基为：MS+2.5mg/L 2.4‑D+18.0g/L蔗糖，pH在5.0～5.4之间；(3)将共培养后的外植体，在含低浓度草甘膦的分化培养基Ⅰ上筛选培养10天，再接种到含高浓度草甘膦的分化培养基Ⅱ上，诱导生成抗性不定芽；所述分化培养基Ⅰ为：MS+3.0mg/L 6‑BA+0.05mg/L NAA+3.0mg/L AgNO₃+250mg/L Tim+4.5mg/L草甘膦，pH为5.8；所述分化培养基Ⅱ为：MS+3.0mg/L 6‑BA+0.05mg/L NAA+3.0mg/L AgNO₃+250mg/L Tim+9.0mg/L草甘膦，pH为5.8；(4)进行生根培养，获得抗性苗；所述生根培养包括：当抗性不定芽长至3～5cm时，从基部切去愈伤组织，将抗性不定芽转移到生根培养基中；所述生根培养基为：MS+0.2mg/L NAA+4.5mg/L草甘膦，pH为5.8；当抗性苗形成完整根系后，开瓶炼苗一天，取出抗性苗移入1/5MS培养液中，水培1周后，移栽到有机质培养土中。