采用LAMP技术检测牛无浆体方法

摘要

采用LAMP技术检测牛无浆体方法，该检测方法包括LAMP引物设计、LAMP 反应体系建立以及采用LAMP检测方法，所述的 LAMP 检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测，所述的LAMP引物设计利用Primer Explorer V4软件针对牛无浆体16S rRNA基因的6个位点设计4条LAMP引物，引物包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，其中：F3：GGGCATGTAGGTGGTTTGG；B3：GCGTGGACTACCAGGGTAT；FIP：TCTCCCGGACTCCAGTCTGGTAAAGGTGAAATGCCAGGGC；BIP：ATTAGGAGGAACACCAGTGGCGCACGCTTTCGCACCTCAG。该法以牛无浆体16S rRNA为靶基因位点，具有快速、灵敏、高效、低成本等特点，为牛无浆体病的病原检测提供新的技术方法。

主权项

一种引物组合在制备采用LAMP技术检测牛无浆体的试剂中的应用，包括4条LAMP引物，引物包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，其中：F3：GGGCATGTAGGTGGTTTGG；B3：GCGTGGACTACCAGGGTAT；FIP：TCTCCCGGACTCCAGTCTGGTAAAGGTGAAATGCCAGGGC；BIP：ATTAGGAGGAACACCAGTGGCGCACGCTTTCGCACCTCAG；所述试剂还包括LAMP 反应体系，LAMP反应体系包括：1）引物混合液：外引物为F3和B3各0.2 µmol/L，内引物为FIP和BIP各1.6 µmol/L，外内引物比为1：8；2）反应混合液：0.8 mol/L三甲铵乙内酯，8 mmol/L硫酸镁，1.4 mmol/L核苷酸混合物，8 U/25 µL Bst DNA 聚合酶；3）2µl DNA模版；加灭菌双蒸馏水至25 µL；所述LAMP 反应体系的反应条件，将引物混合液和反应混合液混合均匀后加入2 µL DNA模版，在60‑65℃保温30‑90min；还含有荧光可视化检测，荧光可视化检测采用SYBR Green I染料，在每个管盖内侧添加1μL稀释10倍的SYRB Green I原液，合上管盖，反应结束后，轻甩反应管，使染料与产物混合。