一个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测

摘要

本发明公开一个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测。本发明通过构建尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶（UXS6）基因与表达载体pEGX-4T-2的重组质粒，导入到细菌中进行原核表达，将UXS6蛋白与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸反应后用高效液相色谱仪进行功能检测，并测定该酶在不同温度及不同pH值下酶活性反应的最适条件。本发明通过将重组质粒浸染烟草，进行过表达，进一步探讨尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶在植物中的作用。由于反应后生成尿苷二磷酸木糖，是半纤维素木聚糖的底物，在工业上具有重要的应用价值。本发明为工业需求提供了一种人为的可靠的途径，可根据现实需要沉默或过表达植物中葡萄糖醛酸基因，从而获得最大的经济效益。

主权项

一个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测方法，其特征在于具体包括如下步骤：①克隆USX6基因，并将其连接到载体pGEX‑4T‑2上，构建重组质粒pGEX‑4T‑2‑UXS6；将重组质粒pGEX‑4T‑2‑UXS6导入大肠杆菌BL21感受态细胞中进行表达，收集表达产物，并对其进行纯化、浓缩，得到UXS6蛋白；并进行SDS‑PAGE分析；将UXS6蛋白注入到小鼠体内，并抽取腹水，离心后吸取上清获得抗体；并进行Western‑blot检测；②将步骤①获得的UXS6蛋白与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸反应，反应产物进行高效液相色谱分析，并以GST蛋白为对照；③以获得的cDNA为模板，并设计带有Gateway位点的引物，其中，横线部分为同源重组序列：UXS6‑F2：5′‑GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGTCTAATTCTTCTAACGG‑3′；UXS6‑R2：5′‑GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTTCTTCGGAACACCAAGCCTTAG‑3′；进行PCR扩增，将所得片段与pDONR207进行BP反应，得到重组质粒pDONR207‑UXS6，将重组质粒pDONR207‑UXS6进行测序，于‑20℃保存测序正确质粒；将重组质粒pDONR207‑UXS6与双元载体pEarley101进行LR反应，转入至双元载体pEarley101中，得到重组质粒pEarley101‑p35S::UXS6，测序正确后提取质粒；④将步骤③中的重组质粒pEarley101‑p35S::UXS6导入到农杆菌中，用转化成功的农杆菌浸染烟草，进行过量表达，将其过表达产物进行Western‑blot检测；⑤从Columbia野生型拟南芥的根，茎上部，茎中部，茎下部，幼苗，叶子，花蕾，果荚中提取RNA，反转录成cDNA，再进行PCR，测定UXS6在各个组织部位的表达水平；⑥从步骤④中的农杆菌浸染的烟草中提取总蛋白，并提取未转化的烟草中的总蛋白做空白对照；⑦将步骤⑥中的总蛋白分别进行超滤后，与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸反应，将其反应产物用高效液相色谱检测；⑧将步骤①中得到的UXS6蛋白，与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸反应，分别测定在不同温度和不同pH值对酶活性的影响；将其反应产物用高效液相色谱检测；步骤②、⑦和⑧中所述的高效液相色谱，其中，高效液相色谱的色谱柱为COSMOSIL 5C18‑AR‑II，流动相A为pH＝7.0的20mM乙酸三乙胺，流动相B为pH＝7.0的含有10％乙腈的20mM乙酸三乙胺；分析条件为用100％流动相A冲洗柱子10分钟，然后以每分钟上升1％的浓度上升流动相B的浓度，冲洗15min。