一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法

摘要

本发明公开了一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法，包括以下步骤：（1）采集人脂肪组织；（2）获取和分离人脂肪干细胞；（3）干细胞培养；（4）检测、冻存；（5）建库。本发明采用D-Hanks平衡盐液配制的含有Ⅰ型和Ⅵ型胶原酶的混合胶原酶对脂肪组织进行消化，使得组织消化的更彻底，明显降低杂细胞数量和除去组织块；用含有10-15%胎牛血清、10³-10⁵U/mlLIF的MCDB-201培养液对分离后的干细胞进行培养，细胞增殖快、形态好，能有效抑制干细胞的分化，保证原代干细胞的特性，同时还能促进人脂肪干细胞的长期生长，以及保持自我更新及多向分化潜能等特点；将得到的干细胞建库保存，保证了更为优质的种子细胞来源。

主权项

一种人脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集人脂肪组织；(2)获取和分离人脂肪干细胞：取采集的脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，剪碎成1‑2mm³大小组织块，用pH值为7.2‑7.4的D‑Hanks平衡盐液洗涤多次至洗出液清亮，去除残留的血液，加入与脂肪组织等体积的0.2‑0.4％(m/v)混合胶原酶，在37℃温度条件下均匀震荡消化40‑80分钟，再置于离心机中以1600‑1800转/分钟的转速离心4‑10分钟，去除表层脂肪，将底层细胞用pH值为7.2‑7.4的D‑Hanks平衡盐液反复清洗，清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以1200转/分钟离心5‑10分钟，弃去上清液，获得干细胞；所述混合胶原酶由Ⅰ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶组成，消化脂肪组织时的终浓度为0.1％‑0.2％(m/v)，所述混合胶原酶的1％(m/v)母液配制方法为：100mL D‑Hanks平衡盐溶液中加入0.7g Ⅰ型胶原酶、0.3gⅣ型胶原酶；(3)干细胞培养：将获得的干细胞按照2‑3×10⁴/cm²的密度接种于培养瓶，加入10mL含胎牛血清的培养液，置于37℃、CO₂浓度5％的培养箱中进行培养，1‑2天后将原培养液吸弃，更换新鲜的含胎牛血清的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶‑EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞；所述培养液是含有10‑15％胎牛血清、10³‑10⁵U/ml LIF的MCDB‑201培养液；(4)检测、冻存：检测和冻存同时进行，在细胞冻存过程中进行免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测以确定其是否达到合格标准；冻存步骤为：向获得的人脂肪成体干细胞中加入胎牛血清，比例干细胞数/胎牛血清为1‑2×10⁶细胞/0.9mL，充分混匀，待用；在冷冻管和冷冻盒上编码；将上述人脂肪成体干细胞悬液与冻存液按照1：1比例加入到冷冻管内混合，封盖，震荡，充分混匀，迅速移入到‑80℃冰箱内；24小时后，按照编号放到相应冷冻架上移入液氮中长期保存，待检测结果出来之后，将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃。