一种高效率基因定向克隆的方法

摘要

本发明公开一种高效率基因定向克隆的方法。该方法利用Topoisomerase I室温下5分钟快速连接以及体外环化原理实现高效率定向克隆的方法。该方法包括：带有Topoisomerase I酶识别位点以及定向序列的载体、定向引物的设计、PCR片段的制备、以及构建目标基因的重组载体。由于所用载体带有原核表达载体的所有调控元件，因此，PCR产物可以连接该载体，经PCR鉴定后无需确定目的基因的连接方向，即可直接用于原核表达。

主权项

一种高效率基因定向克隆的方法，该方法包括以下步骤：(1)载体准备：所述载体是一端为偶联拓扑异构酶I的平末端，另一端为由6个碱基组成的突出端的定向克隆或表达载体；(2)引物设计一条引物为常规引物，另一条引物为定向引物，其中，所述常规引物为无额外碱基和无磷酸化的与插入片段DNA互补的引物，所述定向引物的5’端依次为与步骤(1)中载体上突出端的6个碱基互补配对的碱基序列和拓扑异构酶I识别位点的互补序列“AAGGG”，且磷酸化；(3)PCR扩增，获得插入片段DNA使用步骤(2)的引物对模板DNA进行PCR扩增；(4)反应将载体，插入片段DNA，拓扑异构酶I混合，室温5分钟，获得环化产物。