一种以滇池蓝藻水华为原料提取纯化微囊藻毒素LR、RR的方法

摘要

本发明提供一种以滇池蓝藻水华为原料提取纯化微囊藻毒素LR、RR的方法，包括以下几个步骤：A、用生物网捞取滇池爆发期的水华，再通过过滤筛过滤藻样；B、对处理后的藻样进行反复冻融处理；C、将经过B步骤处理后的藻样浸泡在乙酸溶液中，浸泡过程中，同时配以超声波仪，进一步破坏细胞壁，离心，取上清液；D、上清液经活化后的固相萃取柱；E、富集结束后固相萃取柱清洗后，待干燥后，再洗脱微囊藻毒素；F、将步骤E获得的洗脱液通过硅胶小柱，用甲醇洗脱硅胶小柱，从甲醇中吸附溶解于其中的微囊藻毒素；G、洗脱液上旋转蒸发仪浓缩；H、利用高效液相色谱，分离微囊藻毒素LR、RR；I、提纯。本发明制出的成品纯度高。

主权项

一种以滇池蓝藻水华为原料提取纯化微囊藻毒素LR、RR的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：步骤1、用25号浮游生物网从滇池捞取新鲜藻样，在实验室内用60目的筛过滤藻样，除去较大群体和杂质；而后又用200目的筛过滤，除去个体较小的藻，以提高藻样中微囊藻的优势度；步骤2、将处理后的藻样进行反复3次冻融，并置于‑20℃低温冰箱中储存待用；步骤3、利用真空冻干机，对藻样进行脱水，称取80克干藻粉浸泡在5L，质量浓度为5%的乙酸溶液中，加以超声波仪震荡，经1个小时的浸泡后，以转速5000转/分钟离心20分钟，取上清液；步骤4、将上清液以每分钟10mL的速度通过经活化的C18固相萃取小柱，以富集其中的微囊藻毒素；步骤5、富集结束后每只C18小柱先用6mL体积浓度20%的甲醇清洗，以去除一部分杂质，待C18小柱干燥后，用6mL100%的甲醇洗脱微囊藻毒素；步骤6、将洗脱液等分为5份，每份以每分钟10mL的速度通过1支活化的硅胶柱；然后用体积浓度70%甲醇将吸附在硅胶柱上微囊藻毒素洗脱下来，并置于50mL旋转蒸发瓶中；步骤7、将装于旋转蒸发瓶中的洗脱液利用旋转蒸发仪进行浓缩；浓缩使洗脱液体积减少至原来的15%；步骤8、利用制备型高效液相色谱，分离上步浓缩液中的微囊藻毒素LR、RR和杂质，每次进样量为5mL；步骤9、将收集到的含有微囊藻毒素LR、RR组分的液相色谱流出液，分别用旋转蒸发仪进行浓缩，直至溶液中的甲醇浓度降至20%以下；分别将含有微囊藻毒素LR、RR组分的浓缩液以每分钟10mL的速度通过经活化的C18固相萃取小柱以富集其中的微囊藻毒素LR、RR；步骤10、将上步骤获得到的含有微囊藻毒素LR、RR的甲醇溶液分别用氮吹仪进行浓缩，浓缩的程度以微囊藻毒素LR、RR不析出为准；步骤11、将上步骤得到的微囊藻毒素LR、RR的甲醇溶液，用毛细管沾取，涂到薄层层析板距下端1.5cm处；在涂薄层层析板的过程中，需要注意不要将板子上的硅胶层划破，反复涂抹；步骤12、配制组分为：体积比：三氯甲烷60%、甲醇30%、水10%的展开液；将展开液加入层析缸中，将薄层层析板被涂抹过的一端作为下端放入层析缸中；步骤13、当展开液上升到距离薄层层析板上端1cm处，即可结束展开过程；将薄层层析板取出干燥后，置于紫外灯下观察，确定藻毒素所在位置，并用铅笔将该区域画出 ，刮下并收集薄层层析板上藻毒素所在区域的硅胶；步骤14、在一个漏斗指管里，垫上一薄层石英棉，再垫上一薄层硅胶粉末，然后将上一步骤获得的硅胶粉末放入，再盖上一薄层硅胶；配制组分为：体积浓度80%甲醇、20%pH=3、0.05moL/L磷酸二氢钾缓冲溶液50mL作为提取液；将10mL提取液从漏斗指管上部加入，自然滤过硅胶，并收集滤出液；步骤15、合并上述步骤获得的含同一种毒素的提取液，用氮吹仪进行浓缩，去除其中大部分的甲醇，或加入适量的水使甲醇的比例低于5%，分别将含有微囊藻毒素LR、RR的提取液以10mL/min的流速经过活化的C18小柱，用体积浓度20%的甲醇清洗小柱，去除磷酸和硅胶；再用体积浓度80%的甲醇将微囊藻毒素LR、RR从小柱下洗脱下来，并收集该洗脱液；步骤16、用氮吹仪将获得的洗脱液吹干，即可获得干燥的微囊藻毒素LR、RR样品；步骤17、产率的计算：按照与制备方法相同的方法，抽取原料中的部分藻样进行测定；步骤18、计算纯度。