一种凝血因子基因突变的定点修复载体系统及方法

摘要

本发明公开一种对凝血因子F8/F9进行原位修复的方法，包括：在目标基因组序列中，选定凝血因子基因的突变位点为原位修复的基因位点；设计CRISPR/Cas系统的sgRNA序列的核酸酶的结合位点；设计用于原位修复的同源重组修复供体序列；将核酸酶蛋白和/或sgRNA、所述同源重组修复供体的核酸序列通过递送载体输送至原位修复的基因位点中；通过核酸酶在所述基因原位修复位点造成基因组DNA损伤；所述同源重组供体序列插入到所述基因原位修复位点内，修复基因或补充基因的表达。本发明方法对于凝血因子突变位点的原位修复指明了研究方法和临床应用的可能性，该研究方法具有定点精确导入，更加安全可控，靶点明确的优点。

主权项

一种对凝血因子F8/F9进行原位修复的方法，其特征在于，步骤包括：(1)在目标基因组序列中，选定凝血因子基因的突变位点为原位修复的基因位点；(2)根据选定的基因原位修复位点，设计CRISPR/Cas系统的sgRNA序列的核酸酶的结合位点；(3)设计用于原位修复的同源重组修复供体序列；(4)将核酸酶蛋白和/或sgRNA、所述同源重组修复供体的核酸序列通过递送载体输送至原位修复的基因位点或安全基因座当中，其中核酸酶蛋白是CRISPR/Cas9蛋白，或与上述蛋白具有同源性的能够引起特异位点产生DNA单链或双链断裂的核酸酶及其组合；(5)通过核酸酶在所述基因原位修复位点造成基因组DNA损伤；(6)所述同源重组供体序列插入到所述基因原位修复位点内，修复基因或补充基因的表达；其中，所述步骤(1)中，通过在正义链上寻找突变位点附近的N₂₀NGG，或者在反义链上寻找突变位点附近的CCNN₂₀，来确定CRISPR/Cas基因编辑系统所原位修复的靶点，其中所述突变位点是指导致凝血因子失去功能或活性降低或缺失的突变位点；步骤(2)中，可以根据血友病患者所携带的基因突变来设计同源重组修复供体DNA序列，其中所述基因突变选自单碱基或多碱基缺失；步骤(3)中，所述同源重组修复供体序列为同源重组修复序列，其包括用于原位修复单碱基缺失突变的编码凝血因子CDS的部分序列、用于原位修复多碱基缺失突变的编码凝血因子的序列，以及用于原位修复全基因缺失突变的编码凝血因子全基因CDS的序列；步骤(4)中，递送载体选自慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、单链寡核苷酸、线形DNA、环形DNA、被纳米材料或者DNA导入相关材料包裹的DNA或者RNA之任意一种或多种的组合；步骤(5)中，所述同源重组修复供体序列插入到所述基因编辑位点内来修复基因或补充基因的表达；步骤(6)中，所述安全基因座为经过验证可对其进行基因原位修复并不会对健康造成威胁的基因位点。