寻找光合蓝细菌与乙醇耐受相关的生物标记物的方法

摘要

本发明公开了一种寻找光合蓝细菌与乙醇耐受相关的生物标记物的方法，包括如下步骤：(1)对蓝细菌进行乙醇处理培养；(2)代谢物的提取；(3)GC-MS检测及数据处理；(4)主成分分析,利用本发明的方法可以快速地将蓝细菌在乙醇胁迫过程中的生物标记物寻找出来，这些生物标记物为研究蓝细菌乙醇耐受的代谢路径提供靶点，从而为进一步提高蓝细菌的乙醇耐受性提供理论基础。同时也为其他菌株乙醇耐受性的优化提供新的思路和方法。

主权项

寻找光合蓝细菌与乙醇耐受相关的生物标记物的方法，其特征是包括如下步骤：(1)对蓝细菌进行乙醇处理培养：将蓝细菌在新鲜BG‑11培养基中，在光照强度为40‑50μmol·m^‑2·s^‑1，转速为130rpm，温度为28‑30℃条件下培养，在蓝细菌生长到OD630为0.2时，分别取两个10ml菌液，离心，其中一个去上清后加入到50ml新鲜BG‑11培养基中作为对照组；另一个去上清后加入到含有乙醇的50ml新鲜BG‑11培养基中作为实验组，所述实验组中乙醇的体积浓度为1.0％‑2.0％；对照组和实验组在光照强度为40‑50μmol·m^‑2·s^‑1，转速为130rpm，温度28‑30℃条件下培养；(2)代谢物的提取：①细胞收集：在48h和72h两个时间点取样，用紫外分光光度计测对照组和实验组的蓝细菌在48h和72h时的OD730值，按照OD730＝4收集细胞；在4℃,7500‑8000rpm条件下离心10min，弃去上清，各加入1mL pH为7.2～7.4的PBS，将细胞重悬并吹吸混匀，分别加入到1.5mL离心管中，13000rpm常温下离心5min，弃去上清；②细胞代谢物的提取：向步骤(2)①收集到的各个细胞中分别加入1mL体积比为10:3:1的甲醇、氯仿和水的混合液，吹吸混匀；在液氮中反复冻融3‑5次；常温条件下15000rpm离心3min；各吸取100μL上清液分别至新的离心管中，各加入5μL浓度为100μg/mL D‑山梨醇水溶液为内标，混和均匀，放入真空旋转蒸发仪中进行干燥2‑4h；③样品衍生化：向步骤(2)②获得的各样品中分别加入10μL浓度为4mg/mL的甲氧氨基盐酸盐吡啶溶液，30℃，750‑950rpm恒温震荡90‑120min；分别加入90μL N‑甲基‑N‑三氟乙酰胺，37℃下450‑500rpm恒温震荡30‑60min；常温下13000rpm离心10‑15min，分别取上清75μL分别放入样品瓶中进行上样；(3)GC‑MS检测及数据处理：①代谢物检测：用安捷伦GC‑7890偶联MSD5975的气质联用仪对步骤(2)获得的各个样品进行分析测定；色谱条件：色谱柱为HP‑5MS毛细管柱，所述色谱柱规格为30m×250mm ID；进样方式为不分流进样；上样量为1μL；使用氦气为载气，载气流速为1mL/min；进样口温度为230℃；升温程序为：初始温度为45℃，保持2min，之后以5℃/min的速率持续升温至280℃，保持5min，全程共54min；质谱条件：溶剂延时10min，电离方式EI，采用全扫描方式，质荷比扫描范围：m/z 38‑650；②数据处理：GC‑MS分析得到的原始数据采用AMDIS软件进行分析，并与NIST数据库进行匹配，对代谢物进行定性分析；通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，最后再以细胞数目对数据进行标准化，得到对照组和实验组细胞内各个小分子代谢物的相对含量；(4)主成分分析：用SIMCA‑P软件对步骤(3)②获得的对照组和实验组细胞内各个小分子代谢物的相对含量进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大；在载荷图中，各个小分子代谢物用黑色三角表示，距离中心点越远的小分子代谢物，其在乙醇胁迫过程中的差异就越大；通过将得分图与载荷图叠加，得到一个二维散点图，以坐标0.5为截点，分布在半径为0.5的圆以外的代谢物表达差异显著，并且分布在样本周围的代谢物为该样本中差异表达的代谢物，可作为重要的候选标记物进行分析。