一种原位检测半纤维素在植物细胞壁分布的方法

摘要

本发明公开了一种原位检测半纤维素在植物细胞壁分布的方法，首先对植物组织块进行固定、洗涤、脱水、渗透和包埋聚合处理；随后，对包埋后的植物组织块进行超薄切片并将超薄切片收集在镍网上；然后对镍网的载片面进行洗涤、封闭和第一抗体孵育处理；第一抗体孵育后对镍网的载片面进行洗涤并进行第二抗体孵育；最后对镍网的载片面进行染色，用电镜观察镍网的载片面。本发明通过采用可特异性结合不同种类半纤维素的第一抗体，有效地识别区分不同种类的半纤维素，从而可准确、有效地观察不同种类半纤维素在植物细胞壁各微区中的原位分布。

主权项

一种原位检测半纤维素在植物细胞壁分布的方法，包括以下步骤：(1)对植物组织进行切割，形成植物组织块；(2)对植物组织块进行固定；将植物组织块浸入固定液中进行固定；固定过程在室温下进行，先在真空条件下保持30～60min，之后在常压下保持4小时；(3)对植物组织块进行洗涤；将固定后的植物组织块浸入50mM的二甲胂酸钠缓冲溶液中进行洗涤；室温常压下保持10min；洗涤重复3次；(4)对植物组织块进行脱水；将洗涤后的植物组织块依次浸入30v/v％乙醇水溶液1次，50v/v％乙醇水溶液1次，70v/v％乙醇水溶液1次，80v/v％乙醇水溶液1次，90v/v％乙醇水溶液1次，95v/v％乙醇水溶液3次，100％乙醇3次进行脱水；室温常压下每次浸入10min；(5)对植物组织块进行渗透；将脱水后的植物组织块依次浸入50％LR White树脂中1次，100％LR White树脂中2次进行渗透；室温下，每次渗透处理先在真空度为‑0.098MPa条件下保持30～60min，之后在常压下保持10～12小时；(6)对植物组织块进行包埋聚合；将渗透后的植物组织块浸入注满LR White树脂的胶囊中，然后将胶囊置于55～60℃烘箱中，常压下保持18～24小时；(7)对包埋后的植物组织块进行超薄切片，然后将所得植物组织超薄切片收集在镍网上；(8)对镍网的载片面进行洗涤；室温条件下，将镍网的载片面依次轻浮于去离子水的液滴上、含0.1M甘氨酸的0.01M磷酸盐的缓冲溶液的液滴上、去离子水的液滴上和0.01M磷酸盐缓冲溶液的液滴上进行洗涤；对应的洗涤次数和时间分别为：去离子水洗涤2次，每次2min；含0.1M甘氨酸的0.01M磷酸盐的缓冲溶液洗涤1次，30min；去离子水洗涤4次，每次2min；0.01M磷酸盐缓冲溶液洗涤4次，每次2min；(9)对镍网的载片面进行封闭；将镍网的载片面轻浮于含有羊血清的0.01M磷酸盐缓冲溶液的液滴上进行封闭，室温下保持40min；(10)对镍网的载片面进行第一抗体孵育；将镍网的载片面轻浮于第一孵育液内进行孵育，所述第一孵育液含有0.01M磷酸盐缓冲溶液、第一抗体和1w/v％牛血清蛋白；置于无菌的玻璃培养皿中并加盖，在4℃冰箱中孵育2天；(11)对镍网的载片面进行洗涤；先用注射器吸取含有1w/v％牛血清蛋白的0.01M磷酸盐缓冲溶液沿镍网面冲洗1分钟；再将镍网的载片面依次轻浮于0.01M磷酸盐缓冲溶液、pH为7.4的0.05M三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、pH为8.4的0.05M三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液的液滴上进行洗涤；对应的洗涤次数和时间分别为：0.01M磷酸盐缓冲溶液洗涤5次，每次2min；pH为7.4的0.05M三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液洗涤4次，每次1min；pH为8.4的0.05M三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液洗涤4次，每次1min；(12)对镍网的载片面进行第二抗体孵育；将镍网的载片面轻浮于第二孵育液内进行孵育，所述第二孵育液含有0.05M三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、第二抗体和0.5w/v％牛血清蛋白；置于无菌的玻璃培养皿中并加盖，室温孵育4小时；(13)对镍网的载片面进行洗涤；先用注射器吸取0.05M三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液沿镍网面冲洗1分钟；再将镍网的载片面依次轻浮于pH为7.6的0.05M三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、pH为7.4的0.05M三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、去离子水的液滴上进行洗涤；对应的洗涤次数和时间分别为：pH为7.6的0.05M三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液洗涤5次，每次4min；pH为7.4的0.05M三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液洗涤5次，每次4min；去离子水洗涤4次，每次1min；(14)对镍网的载片面进行染色；将镍网的载片面轻浮于双氧乙酸铀的液滴上进行染色，室温下保持10min；(15)对镍网的载片面洗涤后使用透射电子显微镜观察。