SLO蛋白的真核表达和含真核表达SLO蛋白的试剂盒

摘要

本发明提供了一种SLO蛋白的真核表达和含真核表达SLO蛋白的试剂盒。本发明通过真核表达获得SLO蛋白，还利用该蛋白发明了一种检测ASO含量的试剂盒，所述试剂盒由R1试剂、R2试剂和校准品三部分组成，其中R1试剂为磷酸盐缓冲体系，R2试剂为胶乳悬浮液，校准品主要为牛血清基质。本发明采用真核表达系统表达出纯度高、活性强的，并且采用复合乳胶颗粒包被SLO蛋白抗原，解决了目前市场上ASO检测灵敏度不高、重复性欠佳、不能满足临床对ASO定量的要求的问题，明显提高了测定结果的灵敏度、准确性和线性。

主权项

一种含真核表达SLO蛋白的试剂盒，其特征在于，包含R1试剂、R2试剂及校准品，所述R1试剂为磷酸盐缓冲体系，所述R2试剂为交联了SLO抗原的致敏乳胶悬浮液，所述校准品包括4支不同ASO浓度、溶质含量均相同的牛血清基质；所述SLO抗原的真核表达，具体包括如下步骤：(1)采用真核表达系统，将SLO基因克隆于表达载体的多克隆位点，得到重组载体；所述真核表达系统为高保真的甲醇酵母菌表达系统；(2)重组载体转化到宿主细胞大量扩增后提取重组质粒；所述宿主细胞为大肠杆菌感受态细胞；(3)重组质粒线性化；所述线性化是由SalI进行限制性酶切；(4)接着用电击转化法将线性化的重组质粒转入酵母菌；(5)将步骤(4)得到的酵母菌先在含甘油的培养基中生长，培养至高浓度后，以甲醇为唯一碳源诱导表达外源SLO蛋白；所述步骤(1)中，表达载体包括pPIC9K、pDBLeu、pEXP‑AD502或pPC‑86；所述交联了SLO抗原的致敏乳胶悬浮液的溶剂为pH 7.0～7.6、40～100mmol/L的磷酸盐缓冲液，悬浮颗粒及溶质在所述悬浮液中的含量为：复合SLO致敏颗粒0.1～1％，乙二胺四乙酸二钠5～25mmol/L，脱脂奶粉0.05～1％，NaN₃0.2～1.5％；所述复合SLO致敏颗粒的制备为：含有SLO蛋白的20mmol/L、pH 7.4的磷酸缓冲液和聚苯乙烯胶乳以30：100的质量比混合，37℃吸附8小时，透析除去未连接上的SLO蛋白，加入封闭液，封闭2小时，离心去上清即得；所述封闭液含有0.1％脱脂奶粉、0.2mmol/L的甘氨酸；所述复合SLO致敏颗粒的制备采用物理吸附与化学交联相结合实现链球菌溶血素O抗原与胶乳颗粒的交联。