一种罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒及其检测方法，属于检测技术领域。所述的试剂盒包含酶标板，包被缓冲液、封闭液、洗涤缓冲液、一抗血清，稀释液、二抗羊抗兔IgG-HRP酶标抗体，底物显色液和终止液。其中，所用的包被抗原为用包被缓冲液稀释的浓度为10⁶～10⁸cfu/mL的病原菌液。该间接ELISA 方法是将以经分离并培养得到的病原菌液为作为包被抗原；而且判断标准如下：（被检样品OD₄₅₀ 值－空白对照OD₄₅₀值）/（阴性对照样品OD₄₅₀值－空白对照OD₄₅₀值）≥2.1。通过特异性试验、阻断实验、重复性试验及临床检测，证明本发明具有特异性好、灵敏度高、重复性好及快速、简便、准确的特点，可用于罗非鱼源无乳链球菌的临床大规模检测和流行病学调查。

主权项

一种罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检测试剂盒的检测方法，其特征是步骤为：（1）抗原包被：用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释病原菌，每种病原菌分别设阴性对照孔和空白对照孔，每个被检样品孔和阴性对照孔内分别加入50～150 μL的10⁶～10⁸ cfu/mL浓度的病原菌，空白对照孔加入50～150μL的包被缓冲液，60℃烘箱内 4～12小时烘干；（2）洗板：每个酶标板孔内加入200～300μL PBST洗涤缓冲液，静置1～5分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；（3）封闭：每个酶标板孔内加入100～300μL 0.25%～1% 的BSA封闭液，封闭60～120分钟；空白对照孔不加任何试剂；（4）洗板：每个酶标板孔内加入200～300μL PBST洗涤液，静置1～5分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；（5）加一抗阳性血清：一抗阳性血清用稀释液稀释5000～30000倍后，每孔100μL，37℃孵育60～90min；被检样品孔加一抗阳性血清，阴性对照孔加阴性对照血清，空白对照孔不加任何试剂；（6）洗板：每个酶标板孔内加入200～300μL PBST洗涤液，静置1～5分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；（7）加酶标二抗：每孔加入工作浓度1000～2000倍稀释的50～150μL的羊抗兔IgG‑HRP酶标抗体，37℃孵育60～90min；（8）洗板：每个酶标板孔内加入200～300μL PBST洗涤液，静置1～5分钟，甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3～5次；（9）加底物：每孔加入可溶型单组分TMB底物溶液 50～150μL，37℃避光反应15～20min；（10）终止反应：每孔加入终止液50μL；（11）读数：在酶标仪450nm下读数；（12）结果的判断：a、肉眼观察：与阴性对照孔进行比较，若被检样品孔中现黄色，则被检样品孔为阳性；若被检样品孔与阴性对照孔一样为无色，则被检样品孔为阴性；b、酶标仪检测：（被检样品 OD₄₅₀ 值－空白对照OD₄₅₀ 值）/（阴性对照样品 OD₄₅₀ 值－空白对照OD₄₅₀ 值）≥ 2.1，被检样品孔为阳性，反之则为阴性。