一种检测单糖和二糖的方法及衍生试剂的制备方法

摘要

本发明属于医药领域，涉及一种检测单糖和二糖的方法及衍生试剂的制备方法。检测方法步骤包括：(1)将单糖或二糖用衍生试剂衍生；(2)用液相质谱联用(LC-MS)分析衍生后的样品；所述的衍生试剂包含D3PMP，D5PMP，D8PMP和PMP。本发明的三种氘代衍生试剂可以与普通PMP任意组合联用，也可任意几种联用。将已知量的标准品和未知样品用不同衍生试剂衍生，用LC-MS分析，可以对微量单糖和糖胺聚糖酶解二糖进行定性和定量。该方法可同时对4种样品进行分析，可同时对3种未知量样品进行定量，检测样品用量少，操作耗时短。

主权项

一种检测单糖和二糖的方法，包括如下步骤：(1)将单糖或二糖用衍生试剂衍生；(2)用液相色谱质谱联用(LC‑MS)分析衍生后的样品；其特征在于，所述的衍生试剂为1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮与1‑苯基‑3‑氘代甲基‑5‑吡唑啉酮或1‑氘代苯基‑3‑氘代甲基‑5‑吡唑啉酮中任意一种联用；或者，所述的衍生试剂包含1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮与1‑苯基‑3‑氘代甲基‑5‑吡唑啉酮或1‑氘代苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮或1‑氘代苯基‑3‑氘代甲基‑5‑吡唑啉酮任意两种或三种联用；或者，所述的衍生试剂包含1‑苯基‑3‑氘代甲基‑5‑吡唑啉酮或1‑氘代苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮或1‑氘代苯基‑3‑氘代甲基‑5‑吡唑啉酮任意几种联用；所述的液相色谱质谱联用分析条件包括，液相柱0.3mm×250mm SB‑C18柱5μm，Agilent，流速15μL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02μL；流动相17％B 15min，17％B 30min线性增加到21％B，21％B 15min线性增加到23％B，17％B 15min，紫外检测器DAD 245nm检测；质谱为电喷雾质谱负离子模式；所述衍生试剂1‑苯基‑3‑氘代甲基‑5‑吡唑啉酮的制备方法包括如下步骤：①取氘代乙酸，加入乙醇，氯化亚锡摇匀后，70‑90℃加热回流1‑5h，蒸馏出液体，生成氘代乙酸乙酯，将氘代乙酸乙酯用饱和CaCl₂及硫酸镁干燥，除去乙醇，乙酸，水，得干燥的氘代乙酸乙酯；②向干燥后的氘代乙酸乙酯中加入金属钠，冷凝回流，再加入50％的醋酸，调节pH至6‑7，用饱和氯化钠静置分层，转移上层液体，用无水硫酸钠进行干燥，得氘代乙酰乙酸乙酯；③取苯肼加入乙醇中，再加入步骤②所得的氘代乙酰乙酸乙酯，于70‑85℃条件下反应10h，冷却过滤得1‑苯基‑3‑氘代甲基‑5‑吡唑啉酮；步骤①所述的氘代乙酸和乙醇的体积比为1∶2‑5；步骤③所述的苯肼和氘代乙酰乙酸乙酯的物质的量之比为1∶0.2‑0.8；所述衍生试剂1‑氘代苯基‑3‑氘代甲基‑5‑吡唑啉酮的制备方法包括如下步骤：④取氘代乙酸，加入乙醇，氯化亚锡摇匀后，70‑90℃加热回流1‑5h，蒸馏出液体，生成氘代乙酸乙酯，将氘代乙酸乙酯用饱和CaCl₂及硫酸镁干燥，除去乙醇，乙酸，水，得干燥的氘代乙酸乙酯；⑤向干燥后的氘代乙酸乙酯中加入金属钠，冷凝回流，再加入50％的醋酸，调节pH至6‑7，用饱和氯化钠静置分层，转移上层液体，用无水硫酸钠进行干燥，得氘代乙酰乙酸乙酯；⑥取30％盐酸与水，滴加氘代苯胺，在0‑5℃条件下滴加71.8％亚硝酸钠溶液，搅拌并保持0‑5℃反应3‑5h，得重氮化氘代苯，向重氮化氘代苯中加入亚硫酸氢钠，25％氨水和水，升温至70～85℃，回流反应4h，放入4℃冰箱降温，过滤得氘代苯肼盐酸盐，向氘代苯肼盐酸盐中加入水，加热到50℃，滴加10M的氢氧化钠调节pH至10‑11，搅拌30min，加入乙酸乙酯萃取3次，减压蒸馏得到氘代苯肼；⑦将步骤⑥所得的氘代苯肼溶于乙醇中，加入步骤⑤所得的氘代乙酰乙酸乙酯，于70‑85℃条件下反应10h，冷却过滤，得1‑氘代苯基‑3‑氘代甲基‑5‑吡唑啉酮；步骤④所述的氘代乙酸和乙醇的体积比为1∶2；步骤⑥所述的氘代苯胺与亚硝酸钠的物质的量之比为1∶1；步骤⑦所述的氘代苯肼与氘代乙酰乙酸乙酯的物质的量之比为1∶0.7。