主权项 |
一种快速提取马铃薯晚疫病菌单个孢子囊DNA的方法,其特征在于:具体方法如下:1) 单个孢子囊的分离a.在发病叶片病斑边缘用无菌接种针挑取直径4 mm的马铃薯晚疫病菌菌丝团于25 mL离心管中,加入5‑10 mL无菌水充分混匀后,用灭菌的脱脂棉进行过滤,收集孢子囊悬浮液于2 ml离心管中,并立即进行下一步骤;b.将孢子囊悬浮液浓度调至1个/2 µL,利用直径6 mm的毛细玻璃管自吸6‑8 s,吸取2µL悬浮液,在显微镜下观察,确认毛细管中含有一个孢子囊后转移至0.5mL离心管中,在4℃冰箱中放置2 h,使孢子囊中游动孢子充分释放;2)单个孢子囊DNA的提取a.将CTAB于水浴锅中60℃水浴10 min;b.取10 µL 预热的CTAB液于含有单个孢子囊的0.5 mL离心管中,轻轻振荡,混匀后放置于60℃水浴锅中,水浴15 min;c.水浴后,加10 µL异丙醇于离心管中,轻摇混匀后冰浴15min; d.12000 rpm离心10 min后,弃上清,并把离心管小心倒扣在无菌吸水纸上2 min,去除管内液体;e.70%酒精洗涤沉淀,12000 rpm离心3 min,弃上清,通风橱中放置5 min风干沉淀,加20 µL TE液,溶解,备用。 |