优化episomal技术建立人ips的方法

摘要

本发明涉及一种优化episomal技术建立人ips的方法，本发明是建立在无插入的episomal技术上，通过对reprogramming培养中的氧含量降低为5%，外周血培养液为红系培养液，单核细胞在体外培养8天电转，诱导后建系时换为无feeder的E8培养液，使iPS效率又有显著提高，并且iPS细胞系的建立和扩增效率也有明显提高。为建立人iPS细胞库的提供可行性。

主权项

一种优化episomal技术建立人ips的方法，其特征在于：包括如下步骤：利用ficoll梯度离心技术分离外周血单核细胞，利用红系培养体系，即使用红系诱导培养基培养单核细胞，体外培养8天，利用Amaxa细胞核转染仪电转episomal的pEV SFFV‑OS,pEV SFFV‑MK,pEV SFFV‑B三个质粒，放在feeder上，电转后到利用机械手段建立iPS细胞系之前在低氧条件下培养；低氧条件：5％O₂，5％CO₂，90％N₂的混合气体，利用红系诱导培养基培养1天，再应用质量比1:1红系诱导培养基和hESC培养基培养，而后逐渐换成人ES培养基，培养7天换为CM，即条件培养基：培养新鲜feeder一天的ES培养液,培养12‑15天看到人iPS细胞克隆，20天将每个克隆挑出培养在24孔板中，利用E8培养液培养,传代10代后检测ES特性，合格的为iPS细胞系；所述的红系诱导培养基为在SFM的基础上进一步添加如下组分：SCF终浓度100ng/ml,IL‑3终浓度10ng/ml,EPO终浓度2U/ml，IGF‑1终浓度40ng/ml，地塞米松终浓度1μM，转铁蛋白终浓度100μg/ml；其中SFM组成为：