用于高通量测序的DNA建库方法

摘要

本发明提供一种用于高通量测序的DNA建库方法，特别是cfDNA建库方法，所述方法是在Ion AmpliSeq Library Kit 2.0的标准建库方法的基础上，优化试剂使用量和PCR扩增条件，从而减少反应消耗，使扩增的特异性更高且起始DNA量更低，甚至低至1ng。

主权项

用于高通量测序的DNA建库方法，包括以下步骤：1)多重PCR将分离纯化的DNA进行多重PCR扩增，反应体系为：多重PCR反应条件为：99℃保持2min，然后进行23个循环，每个循环为99℃15s、60℃4min，然后保持在10℃；2)引物部分裂解将1μl FuPa Reagent加入到PCR产物中混匀后，在PCR仪中依次按下述条件运行：50℃10min，55℃10min，60℃20min，然后保持在10℃；3)接头的连接和纯化向步骤2)得到的反应产物中加入2μl的7.5X Switch Solution、1μl的Barcode Adapter、1μl DNA Ligase，在PCR仪中依次按下述条件运行：22℃30min，72℃10min，然后保持在10℃；向上述反应产物中加入22.5μl Agencourt AMPure XP混匀后室温孵育5min，置于磁力架上，溶液澄清后弃尽上清，使用200μl新鲜的70％乙醇清洗磁珠两次，分别弃掉上清，短暂离心后放回磁力架上，吸尽残余液体，室温干燥5分钟后，分别加入25μL的Platinum PCR SuperMix High Fidelity和1μL的Library Amplification Primer，混匀后，重新放回磁力架，待溶液澄清后，取上清；4)扩增以及扩增后纯化将步骤3)中获得的上清按照以下反应条件进行扩增：在98℃保持2min，然后进行7个循环，每个循环为98℃15s、60℃1min，然后保持在10℃；在扩增产物中加入30μl Agencourt AMPure XP，混匀，室温放置5min后，置于磁力架上，直到溶液澄清后，弃掉上清，使用200μl新鲜的70％乙醇清洗磁珠两次，分别弃掉上清，短暂离心后放回磁力架上，吸尽残余液体，室温干燥5分钟。