| 主权项 |
一种利用OPRK1基因的单核苷酸多态性检测绵羊规癖行为的方法，其特征在于：1）血样采集：绵羊后颈静脉采血5‑10 mL，置于内置1‑2.5 mL裂解液的15 mL指型管中，充分摇动至血细胞完全破裂，溶液呈粘稠状；2）引物准备：引物对采用如下的引物对1，SEQ ID NO.1‑2和引物对2，SEQ ID NO.3‑4，SEQ ID NO.1 TAACACAGCCTGCATCT；SEQ ID NO.2 TCCTGCCTACGTGAGGGA；SEQ ID NO.3 AGGACGGGGATGACGAAG；SEQ ID NO.4 ATCATCAACATCTGTAT；引物首先稀释为正常扩增的10倍浓度，‑20℃长期保存，使用时再稀释10倍；3）PCR扩增：PCR反应体系为20 μL，其中0.20 μL的5U/μL的Taq 酶, 2.20 μL含 Mg<sup>2+</sup> 的10×缓冲液, 1.20 μL 浓度为1μmol/L 引物, 1.20 μL 浓度为 2.0 mmol/L dNTPs, 1.40μL浓度为50 ng/L 的基因组 DNA，体系最后用去离子灭菌水补齐至 20μL；PCR反应程序如下：94℃预变性5 min, 然后94℃变性45 s, 54‑56℃退火40 s, 72℃延伸30 s，共33个循环；72℃延伸5 min, 产物4℃保存；4）基因组DNA提取结果确认：从绵羊血样中提取的基因组DNA溶于300 μL TE中，室温溶解24 h后用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明提取的基因组没有降解，长度在30 kb以上，所含DNA符合生物学试验要求；5）PCR扩增产物检测：对引物对1扩增产物进行SSCP分析，结果表现3种基因型，分别命名为AA、AB、BB；对引物对2扩增产物进行SSCP分析，结果表现3种基因型，分别命名为CC、CD、DD；6）OPRK1基因测序结果及同源性分析将引物对1所得AA、BB 2个基因型，引物对2所得CC、DD 两个基因型的克隆产物直接进行测序，并将引物对1所获得的一个杂合体AB型，其PCR产物纯化后直接进行双向测序；将测序结果与其他种属OPRK1基因cDNA序列进行比对，分析同源性，确定获得目的片段即为绵羊OPRK1序列；AA、BB 2个基因型在扩增片段DNA序列118bp处发生T→A突变，根据其在扩增片段上的位置，将该SNP位点命名为T118A；CC、DD 2个基因型在扩增片段DNA序列产物90bp处发生G→A的突变，将该SNP位点命名为G90A；对OPRK1基因SNP位点基因型与绵羊各行为性状进行最小二乘分析，分析上述来自引物对1和引物对2的各基因型对绵羊的修饰、观望、呆立行为的影响。 |
