一种干酪乳杆菌电转化方法

摘要

本发明涉及分子生物学领域，公开了一种干酪乳杆菌电转化方法，包括了干酪乳杆菌电转化的具体方法和步骤，克服了传统电转化重复性不好，转化率低的问题，经过合理优化的干酪乳杆菌电转化方法，可以应用于多种不同外源DNA表达，潜在的推动了生物药物基因的高效表达。

主权项

一种干酪乳杆菌电转化方法，其特征在于，所述的方法包括了干酪乳杆菌培养、干酪乳杆菌电转化和转化后再培养，具体步骤为：干酪乳杆菌培养：A.从低温冷冻冰箱取出一支加入甘油保存的干酪乳杆菌菌种，在MRS固体培养基上划线，37℃厌氧倒置培养；B.用无菌的接菌环挑取在MRS上生长好的菌落至试管里MRS液体培养基中，37℃静止培养过夜；C.第二日将前一天生长好的菌液1mL转接到50mL MRS液体里，37℃静止生长至菌液600nm处紫外吸收值为0.5‑0.6时，准备干酪乳杆菌电转化；干酪乳杆菌电转化:D.将干酪乳杆菌移入50mL离心管里，放到冰盒里静置20分钟后，放到提前预冷到4℃离心机中5000r/min，5分钟，弃掉上清，留下沉淀；向沉淀里移入40mL EPWB溶液，使沉淀悬浮于EPWB溶液中，放到提前预冷到4℃的离心机中5000r/min，5分钟，弃掉水相，留下菌体，此步骤重复3次，用40mL EPB溶液洗涤菌体一次，弃上清；E.菌体用400μL的EPB溶液重悬，分装500‑300μL/支(现用现配)，用于电转；F.质粒DNA1μg加入到之前制备好的干酪乳杆菌感受态细胞中，轻轻混合，冰浴10分钟；G.将质粒与干酪乳杆菌感受态转入提前预冷的2mm电击杯中，冰浴10分钟；H.用滤纸将电转化杯表面擦干，放入电转仪中，调节电压2.3kV、电阻200Ω、电容25μF，脉冲时间约为4‑5ms；I.向电击杯中快速加入900μL的含有0.5％甘氨酸的MRS，轻轻地用移液器吹吸混合后移到一个无菌的Eppendorf管中，放到提前调至37℃的80‑100rpm/min摇床内孵育1.5‑3小时；转化后再培养:J.孵育后的混合液离心，留下100μL上清，重新悬浮；然后涂布于含有选择压力的MRS琼脂平板上，37℃无氧倒置培养24‑36小时。