一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法

摘要

本发明公开了一种鼠伤寒沙门氏菌核酸检测方法。所述方法为：根据鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因设计特异性的引物序列，提取待测样品的DNA为模板，进行LAMP反应；对LAMP结果进行分析，若LAMP扩增结果为阳性，则待测样品含有鼠伤寒沙门氏菌。本发明提供的针对鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，具有简便、快速、特异、灵敏和经济的优点，结果判断方法简便，适合于临床或者基层实验室使用，具有广阔的应用前景。

主权项

一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法，其特征在于，以非诊断为目的，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域，其具体步骤为：(1)根据鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因设计环介导等温扩增引物；(2)提取待检测样品DNA及阳性对照鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因组DNA或其它鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA、或含检测靶序列的重组质粒DNA；(3)鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测的反应体系组成如下：2xU‑LAMP反应混合液10μl，其组成为：40mM Tris‑HCl、pH 8.8、20mM KCl、20mM (NH₄)₂SO₄、10mM MgSO₄、0.2％ Triton X‑100、2.4mM dNTPs、1.6M甜菜碱；10x引物混合液1μl，其组成为：F3为2μM，B3为2μM，BIP为12μM，FIP为12μM，LF为3μM，LB为3μM；模板DNA 1μl、Bst聚合酶0.75μl、补水至20μl，同时设置阴阳性对照扩增体系，阴阳性对照扩增体系除模板外，其余成分同上述检测反应体系；其中F3是由“5’‑GCATTTATCCAGGCCGTTCA‑3’”的序列组成的外引物，B3是由“5’‑AACAAGACATCGGGATCCAG‑3’”序列组成的外引物，BIP是由“5’‑GCGCTGCCGGTTTTAATACTGC‑CACTGCCGTAAGCATTGTTC‑3’”序列组成的内引物，FIP是由“5’‑AGCCGTTCCCAAAGAGGATGG‑TGTTTTACCTCAATGGCGGA‑3’”序列组成的内引物，LF是由“5’‑TTCCAAAGTGCGGCATGGT‑3’”序列组成的上游环游引物，LB是由“5’‑CAGCACAGAATGATGCTGAAGT‑3’”序列组成的上游环游引物；(4)特定的程序为：64.0℃45min→80℃5min→‑20℃保存；(5)LAMP反应结束LAMP反应结果进行的分析及判定的方法包括：①肉眼直接观察反应浊度②琼脂糖凝胶电泳分析③肉眼观察反应液颜色的变化.所述3种方法中可选一种或多种作为判断标准，其中：①肉眼直接观察反应管内溶液的浊度变化：在核酸的合成过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与Mg²⁺结合，产生焦磷酸镁沉淀，且随反应的进行沉淀量加大，在反应结束后，直接通过肉眼判读，反应液出现浑浊沉淀，则说明该管扩增反应为阳性；反之，则为阴性；②琼脂糖凝胶电泳分析：取LAMP扩增产物5μl，在2％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下出现典型的梯状条带，则说明该管扩增反应为阳性；反之，则为阴性；③加入1/1000的Sybrgreen I染料观察反应液颜色变化或者紫外照射下检测荧光：如果含有扩增产物，反应混合液为绿色，否则保持Sybrgreen I的橙色不变；在紫外照射的条件下，能够检测到荧光则为阳性；反之，则为阴性；利用环介导等温扩增技术扩增鼠伤寒沙门氏菌的特定靶核酸序列区域；步骤(3)中所述的阴阳性对照扩增体系中，阳性对照模板为含有鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因组DNA或其它鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA或含检测靶序列的重组质粒DNA，阴性对照的模板为灭菌超纯水，并使用电泳分析或Sybrgreen I荧光染料紫外灯下显色同时检测阴阳对照扩增产物；针对鼠伤寒沙门氏菌中的Genbank登录号为NC_003197.1的STM4493基因设计环介导等温扩增特异性引物。