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一种神经系统突触位点的免疫荧光染色方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)挑选：挑选每种表型的各生长时期没有饥饿的秀丽隐杆线虫2‑4盘；(2)速冻：用线虫磷酸盐缓冲液洗脱步骤(1)挑选的秀丽隐杆线虫，并用线虫磷酸盐缓冲液将洗脱后的秀丽隐杆线虫收集到试管中，将试管放在冰上5min，吸去上清液，然后用1ml ddH<sub>2</sub>O对秀丽隐杆线虫重复洗涤3次，再吸去上清液，用80ul的体积分数为0.025％的戊二醛溶液悬浮秀丽隐杆线虫；取两块载玻片，将秀丽隐杆线虫的戊二醛悬浮液转移到一块载玻片上，用另一块载玻片合盖在载有秀丽隐杆线虫戊二醛悬浮液的载玻片上方，使秀丽隐杆线虫被上下两块载玻片夹住呈三明治型，然后用无尘纸将三明治型载玻片边缘的液体吸去，使线虫蠕动困难，然后将三明治型载玻片放置在干冰上，放置时间30min以上；(3)固定：将步骤(2)速冻后的载玻片从干冰中取出，将三明治型载玻片迅速掰开，秀丽隐杆线虫的外表皮被打开，保持了秀丽隐杆线虫虫体的组织结构与形态的完整性，然后将载玻片浸没在固定液中，使载玻片上的秀丽隐杆线虫虫体与固定液充分接触；将在固定液中浸没后的载玻片转移到离心管中，离心管中装有40ml1x磷酸盐缓冲液，同种基因型的秀丽隐杆线虫转移在同一离心管中，保存温度为4℃，使秀丽隐杆线虫从载玻片上洗脱到离心管中，并使秀丽隐杆线虫收集在离心管的管底，吸去上清液，将秀丽隐杆线虫转移到试管中，再次吸去上清液，把试管中的沉积物保存在冰上；(4)抗体染色：向步骤(3)固定后的秀丽隐杆线虫中抗体非特异性蛋白加入500uL体积分数为0.2％聚乙二醇辛基苯基醚和质量分数为0.2％明胶， 在常温下封闭30min，然后重悬秀丽隐杆线虫，每一染色组取约20uL的秀丽隐杆线虫放到EP管中，静置3‑5min后，移除上清液，保留秀丽隐杆线虫，将一抗抗体溶液加到EP管中，并轻轻混匀，将EP管侧放在支架上，并将支架放在摇床上摇动过夜，室温为4℃，第二天，将EP管正放，并静置5min，移除一抗抗体上清液；用1mL体积分数为0.2％聚乙二醇辛基苯基醚和质量分数为0.1％明胶进行洗涤，洗涤后将放有EP管的支架放在转动摇床上，摇动20min，使重悬的秀丽隐杆线虫自然沉淀下来，重复此操作四次，使上清液完全去除；每一染色组加入50uL的二抗抗体稀释溶液到EP管中，并在二抗抗体稀释溶液中加入DAPI进行核染色，然后将EP管侧放在支架上，并将支架放在摇床上摇动过夜，温度为4℃，第二天，将EP管正放，并静置5min，移除二抗抗体上清液；用1mL体积分数为0.2％聚乙二醇辛基苯基醚和质量分数为0.1％G明胶进行洗涤，洗涤后将EP管的支架放在转动摇床上，摇动20min，使重悬的秀丽隐杆线虫自然沉淀下来，重复此操作四次；用1X磷酸盐缓冲液进行洗涤，将EP管的支架放在转动摇床上，摇动20min，使重悬的秀丽隐杆线虫自然沉淀下来，然后用15uL的封片液对已经染色的秀丽隐杆线虫进行封片；即神经系统突触位点的免疫荧光染色完成。 |
