一种立克次体多重荧光PCR检测方法

摘要

本发明公开一种立克次体多重荧光PCR检测方法，涉及PCR检测领域,从引物探针的特异性、反应体系的关键因子、质控构建等多个方面对多重荧光PCR进行了探索研究，建立了流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、Q热3种立克次体多重实时荧光定量PCR方法，明显提高了三种立克次体检测的灵敏性和特异性，而且大大缩短三种立克次体病原体的检测周期，对于提高国境口岸的检疫通关速度，阻止传染病在国境口岸传入传出，成功应对突发公共卫生事件，保卫人民的生命和财产安全，具有重大的意义。

主权项

一种立克次体多重荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）提取DNA；（2）设计引物和荧光探针，根据 TaqMan荧光探针PCR检测方法，确定引物和荧光探针的设计原则，分析Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体基因的序列，针对每种病原体各设计三组引物和探针，探针分别标记不同染料，其中Q热立克次体探针荧光基团为FAM，猝灭基团为BHQ1；普氏立克次体探针荧光基团为HEX，猝灭基团为BHQ1；莫氏立克次体探针荧光基团为CalRed610，猝灭基团为BHQ2；设计的引物探针分别命名为：Q‑F1——Q‑R1——Q‑P1Q‑F2——Q‑R2——Q‑P2Q‑F3——Q‑R3——Q‑P3PROW‑F1——PROW‑R1——PROW‑P1PROW‑F2——PROW‑R2——PROW‑P2PROW‑F3——PROW‑R3——PROW‑P3TYPHI‑F1——TYPHI‑R1——TYPHI‑P1TYPHI‑F2——TYPHI‑R2——TYPHI‑P2TYPHI‑F3——TYPHI‑R3——TYPHI‑P3；（3）合成阳物对照品：化学合成含目的扩增片段序列的质粒作为阳性对照品，将合成的产物分别命名为Q‑Z1、Q‑Z2、Q‑Z3；PROW‑Z1、PROW‑Z2、PROW‑Z3；TYPHI‑Z1、TYPHI‑Z2、TYPHI‑Z3，分别对应每种病原体的三组引物探针；（4）配制阳物对照品：将Q‑Z1按100000倍稀释后作为阳性对照品，标记为 Q‑Z11，取Q‑Z11稀释10倍，得到Q‑Z12；再取Q‑Z12稀释10倍，得到Q‑Z13；再取 Q‑Z13稀释10倍，得到Q‑Z14；按照上面的稀释方法分别将Q‑Z1、Q‑Z2、Q‑Z3；PROW‑Z1、PROW‑Z2、PROW‑Z3；TYPHI‑Z1、TYPHI‑Z2、TYPHI‑Z3分别稀释成：Q‑Z11、Q‑Z12、Q‑Z13、Q‑Z14Q‑Z21、Q‑Z22、Q‑Z23、Q‑Z24Q‑Z31、Q‑Z32、Q‑Z33、Q‑Z34PROW‑Z11、PROW‑Z12、PROW‑Z13、PROW‑Z14PROW‑Z21、PROW‑Z22、PROW‑Z23、PROW‑Z24PROW‑Z31、PROW‑Z32、PROW‑Z33、PROW‑Z34TYPHI‑Z11、TYPHI‑Z12、TYPHI‑Z13、TYPHI‑Z14TYPHI‑Z21、TYPHI‑Z22、TYPHI‑Z23、TYPHI‑Z24TYPHI‑Z31、TYPHI‑Z32、TYPHI‑Z33、TYPHI‑Z34；（5）选择引物和荧光探针，用每个病原体的三组引物和探针分别扩增各自对应的稀释好的阳性对照品，观察它们扩增的能力来确定最佳引物探针组；取稀释的三组质粒分别作为各自对应引物探针检测的样品，每组各浓度样本重复2次；（6）对多重荧光PCR检测体系进行优化，最初的荧光PCR检测体系为40μL体系，最初的荧光PCR检测循环参数设置为：94℃×2min，1个循环；94℃×15s→60℃×1min（荧光采集），40个循环；优化探针用量，根据基本荧光PCR体系的扩增情况，对探针的用量进行调整，分别选择每条探针(20μM)体积 0.2μL、0.1μL、0.05μL进行优化，以对应的质粒作为检测样本，每组样本重复 2次；优化Mg²⁺用量，根据基本荧光 PCR 体系的扩增情况，对Mg²⁺的用量进行调整，分别选择MgCl₂(25 mM) 5μL、4μL、3.2μL进行优化；优化反应条件，根据引物和探针的退火温度，分别选择 58℃、60℃、62℃进行优化；（7）对多重荧光PCR反应体系的方法学验证，①灵敏度验证，将约为10 copies/mL质粒原液分别稀释成 10⁵、10⁴、5×10³、10³、5×10²浓度，经优化好的体系确定该检测方法的灵敏度，且每组各浓度样本重复2次；②稳定性验证，选择合适的质粒浓度重复10次进行稳定性验证；③特异性验证，以Q热立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体、土拉热弗朗西丝菌、鼠疫耶尔森氏菌EV76株DNA为模板进行特异性验证；④模拟标本验证，以不携带立克次体的鼠体标本作为实验模板，将添加质粒的鼠体标本和不加质粒的鼠体标本作为对照，同时提取 DNA进行检测。