一种猪传染性胸膜肺炎抗体检测用抗原及制备方法

摘要

本发明的目的是为猪群的猪传染性胸膜肺炎抗体检测提供一种检测用抗原及制备方法。本发明中抗原是从猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1～15型菌株培养物中提取的多糖抗原，为菌体分泌多糖，具有很强的特异性和敏感性，能真实的检测出猪传染性胸膜肺炎抗体；本发明中抗原标准浓度临界值的确定，为酶联免疫吸附试验检测和间接血凝试验检测提供了保障；操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，适合在基层推广应用。

主权项

一种猪传染性胸膜肺炎抗体检测用抗原的制备方法，其特征在于，所述的抗原为猪传染性胸膜肺炎1～15型的混合抗原，其方法包括如下的步骤：1)生产抗原用种子制备将APP1～15型冻干菌种分别划线接种于S琼脂平板上，置5％～10％CO₂条件下，37℃培养16～18小时，分别挑选菌落接种5～6日龄SPF鸡胚卵黄囊内，在37℃继续孵育，收集30小时内死亡的鸡胚卵黄液作为一级种子；再分别取各型菌株一级种子划线接种S琼脂平板，在含5％～10％CO₂条件下37℃培养16～18小时后，挑选菌落或菌苔接种于S肉汤培养基中，置37℃振荡培养10～12小时制成二级种子；2)菌液的培养将各型菌株的二级种子按3％接种到S肉汤中进行扩大培养，37℃振荡培养10～12小时，收获菌液；将各型菌液按终浓度为0.5％加入甲醛溶液，37℃振荡灭活24小时，灭活，将菌液5000r/min离心20min去上清，将沉淀的菌体用pH6.4PBS洗涤2次，将沉淀的菌体用pH6.4PBS稀释，稀释后将各型菌液置于‑20℃以下反复冻融3～5次，然后进行冰浴超声裂解，间歇破碎5min，以8000r/min离心30min，各型上清液分别用0.22μm滤膜无菌抽滤，收集于无菌瓶内，其滤液即为猪传染性胸膜肺炎1～15型单型诊断用抗原液；将APP1～15型标准浓度抗原等量混合完成制备；所述的S琼脂，其制备方法如下：取鸡肉汁100ml,胰蛋白胨血琼脂基质3g，多聚蛋白胨0.5g，加热溶解后调pH值至7.2～7.4，115℃灭菌30分钟，待冷至55℃左右，加入灭活鸡血清5ml，1％辅酶Ⅰ1ml；所述的S肉汤，其制备方法如下：取鸡肉汁100ml，多聚蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，加热溶解后调pH值至7.2～7.4，115℃灭菌30分钟，待冷至55℃左右，加入灭活的鸡血清5ml，1％辅酶Ⅰ1ml。