用于核酸扩增的链霉亲和素修饰聚苯乙烯微球的制备方法

摘要

本发明属于基因组测序领域，具体涉及一种应用于基因组测序核酸扩增的链霉亲和素修饰聚苯乙烯微球的制备方法。首先通过分散聚合方法制备出粒径为25微米的聚苯乙烯微球，然后对聚苯乙烯微球表面进行羧基化，羧基化后的聚苯乙烯微球与链霉亲和素交联从而获得。本发明采用分散聚合法成功制备出单分散PS微球，粒径为25微米并且分散系数低，并且本发明对PS微球的表面羧基化和链霉亲和素修饰的反应条件进行了系统性优化，从而得到了一种链霉亲和素引入量较高的聚苯乙烯微球。

主权项

一种链霉亲和素修饰聚苯乙烯微球的制备方法，其制备的微球可用于基因组测序文库制备中的核酸扩增，所述微球粒径为25微米，具体步骤如下：(1) 向反应容器中加入230g的水、770g的乙二醇单甲醚、1.1g的聚乙烯醇、1.54g的羟丙基纤维素和1.76g的聚乙二醇，通入氮气保护，并在室温下搅拌20分钟至均相体系，然后加入苯乙烯单体473g和偶氮二异丁腈0.73g。升温至75℃，恒温反应8小时；反应结束，冷却至室温，产品离心，并用乙醇反复洗涤，干燥，即得单分散PS 微球；(2) 向三颈瓶中加入0.2g的邻苯二甲酸酐粉末及35ml溶剂，所述溶剂为硝基苯和二氯甲烷的混合物，硝基苯和二氯甲烷的体积比为1:7，超声振荡10min，然后加入10g的聚苯乙烯微球，向反应瓶中通纯氮一段时间后，在搅拌状态下加入0.5g三氯化铝，再通纯氮3min后60℃下反应6小时；(3) 取4mg羧基化PS微球，加入0.9mL乙磺酸缓冲液（MES）混合均匀后加入水溶性碳二亚胺类交联剂（EDC）和N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化，EDC浓度1.2g/L，EDC 与NHS比例1:1之间，室温条件下温和搅拌，时间控制在20min；离心洗涤，转速13000g离心20min，用0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)重复清洗沉淀三遍，去上清，沉淀经0.1mol/L PBS重悬、振荡、超声处理后即得到活化的胶乳微球；取2mg链霉亲和素溶于pH6.7的PBS缓冲液中，加入到1mL经过活化的胶乳微球溶液中，室温条件下温和搅拌，反应时间3h；达到反应时间后，13000g离心20min，沉淀用含有0.05%Tween20的PBS 重复洗涤后的微球经超声分散重悬于PBS缓冲液中，加入30nmol赖氨酸，室温轻微震荡30min，13000g离心20min洗涤三次，超声重悬于0.1M pH7.4 PBS缓冲液中备用。